蛋白质组学及其研究技术概述

刘 伟 刘书广 韩留福

(河北师范大学生命科学学院 石家庄 050024)

人类基因组计划的完成，使人类向“了解自己的生命奥秘”这一目标迈进了一大步。蛋白质是基因功能活动的最终执行者，是生命现象复杂性和多变性的直接体现者。因此，要揭示整个生命活动的规律，就必须研究基因的产物——蛋白质，从基因水平向蛋白质水平的扩展成为了生命科学发展的重要趋势。蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用的能力，同时还具有对外界因素发生反应的能力[1]。因此，只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究(即开展蛋白质组学研究)，才能更加贴近生命现象的本质，认识生命活动的规律[2]。

1 蛋白质组学简介

蛋白质组(proteome)的概念由澳大利亚学者Wilkins和Willian于1994年提出,指由一个基因组(genome)或一个细胞或组织表达的所有蛋白质，也可以指细胞或组织、机体全部蛋白质的存在及活动方式。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。从定义上可以清楚地看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于： 它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它试图从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来阐明生命活动的基本规律。

蛋白质组学的研究内容包括两个方面： ①对蛋白质表达模式的研究，涉及对蛋白质组组成的分析鉴定，是蛋白质组学研究的主要内容，它要求对蛋白质组进行表征，即实现亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次中所有蛋白质的分离、鉴定及图谱化，以及比较、分析在发展变化的生理条件下蛋白质组所发生的变化；②对蛋白质组功能模式的研究，即通过各种技术(如用以建立蛋白质组各组分的相互作用关系的网络图的大规模酵母双杂交技术，以及双向电泳、质谱鉴定和生物信息学等蛋白质组学研究技术)分析蛋白质之间的相互作用，揭示蛋白质的功能。

2 蛋白质组学相关技术

2.1 样品制备技术 激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection， LCM)是组织水平上蛋白质组样品制备的一大突破。LCM是在不破坏组织结构、保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。其原理是： 用乙烯醋酸盐聚合体覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光照射使膜短暂熔化，这时膜与组织在目标位置牢固结合。当膜被提起时，靶细胞便随同膜一起由切片中分离出来。直接在膜上裂解细胞，再进行分离及蛋白质组分析。该技术由Emmert Buck等人于1996年发明[3]，1997年美国Arcturus Engineering Inc将其标准化，并发展成商业化的自动化操作系统，是目前较为理想的细胞提取工具。

2.2 蛋白质分离技术 主要包括双向凝胶电泳、高效液相色谱和毛细管电泳技术。

2.2.1 双向凝胶电泳 蛋白质分离目前首选二维凝胶电泳(two-dimensional gel-electrophoresis， 2-DE)，它作为一种比较成熟的技术已被广泛应用了20余年，也是目前对蛋白质组分辨率最高、重复性最好的分离技术[4]。二维凝胶电泳的基本原理是： 根据蛋白质的等电点和分子量大小不同，进行两次电泳将其分离。由于2-DE利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分离，因此分辨率非常高，一般能分辨到1000～3000个蛋白质点。二维电泳分离后的蛋白质点需经染色显示出来。常用的显色方法有： 考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或同位素标记等。

2.2.2 高效液相色谱 高效液相色谱(high perfor-mance liquid chromatography, HPLC)基于样品分子在固定相和流动相之间的特殊相互作用而实现样品的分离。无须变性处理样品，可实现上样、收集、在线分析的自动化。常用于相对分子量小于1×103的蛋白质、膜蛋白及低丰度蛋白质的分离。

2.2.3 毛细管电泳 毛细管电泳(capillary electrop-horesis, CE)技术是指在高电场强度作用下，对毛细管中的样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离，包括毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦和筛板-SDS毛细管电泳等技术。其优点是可实现在线自动分析，可用于相对分子质量范围不适于2-DE的样品，缺点是存在对复杂样品分离不完全的现象[5]。

2.3 双向凝胶电泳的染色技术 蛋白质经分离后，需要用一定的技术将其显现出来，之后才能对其进行分析。目前有许多方法可以检测双向凝胶上分离的蛋白质，最普通的是用染料或银离子对蛋白质进行染色。下面介绍4种常用的染色方法。

2.3.1 银染法 银染法具有很高的检测灵敏度，可检出2～4ng的蛋白点。Sinha等[6, 7]对银染法进行了重要改进，使之与质谱技术有了匹配度，大大提高了银染法在蛋白质组学中的应用。

2.3.2 荧光染色法 利用荧光染料(如SYPRO Ruby等)对凝胶进行染色，其灵敏度与银染法相似，具有几乎700倍于银染的线性变化范围，并且在多种分析软件上可以看到精确量变，也不存在与质谱的匹配度问题。

2.3.3 胶体考马斯亮蓝染色 利用考马斯亮蓝R250和G250等染料与蛋白质结合能力较强、与凝胶结合能力较差的原理对凝胶进行染色，经过脱色等步骤使蛋白质和凝胶的着色出现较大的反差，使蛋白质点显现。该方法检测灵敏度为8～50ng/蛋白点，虽然灵敏度低，但因其操作简单且与质谱匹配度好，因而一直被广泛应用。

2.3.4 磷蛋白染色 因蛋白质的磷酸化状态是其功能的关键状态，磷蛋白染色变得日益重要[8]。蛋白质在2-DE胶上量变的可视化是比较蛋白质组分析的重中之重。银染有较高的灵敏度但线性变化范围较小，而考马斯亮蓝染色又缺少灵敏度。一些研究者先用荧光染料，再用考马斯亮蓝法染色的复染法来达到灵敏地检测蛋白量变的可视化。

为了使凝胶上的蛋白质点能够被充分检测，放射自显影技术也被应用于双向凝胶成像[9, 10]。

2.4 蛋白质鉴定技术 主要介绍质谱技术和多维蛋白质鉴定技术。

2.4.1 质谱技术 质谱(mass-spectrometric technique)能够产生并分离分子和离子，并根据其质量与电荷的比值进行检测[11]。因产生离子的方法不同而发展起来的质谱包括基质辅助激光光解吸附离子化质谱、电喷雾离子化质谱以及表面增强激光解析离子化质谱。

2.4.2 多维蛋白质鉴定技术 多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology, Mud-PIT)是指将总蛋白混合物通过消化得到各种肽段，上样于强阳离子交换柱，然后不连续梯度洗脱到反向色谱柱上，再用具备梯度洗脱能力的洗脱液洗脱反向色谱柱，对洗脱液直接用质谱进行解析。

2.5 蛋白质间的相关作用分析技术 主要介绍酵母双杂交系统和表面等离子共振技术。

2.5.1 酵母双杂交系统 自Fields和Song[12]建立酵母双杂交系统(yeast two hybrid system)以来，该法已经成为分析蛋白质间相互作用的强有力的方法。它可用来在体内检验蛋白质间、蛋白质与小分子肽、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA间的相互作用，还能用来发现新的功能蛋白质和研究蛋白质的功能。酵母双杂交技术只能反映蛋白质间可能发生作用，还必须结合其他试验才能确认，尤其是要与生理功能研究结合。即使如此，该项技术在蛋白质间的相互作用、筛选新的蛋白质以及研究蛋白质功能等方面仍发挥着重要的作用。

2.5.2 表面等离子共振技术 表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)技术已成为当今一种全新的研究蛋白质之间相互作用的手段。表面等离子体共振SPR生物传感器是利用表面等离子体共振现象和SPR谱峰对金属表面上电介质变化敏感的特点，通过将受体蛋白固定在金属膜上，检测受体蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。SPR技术的特点是测定快速、安全、不需标记物或染料、灵敏度高。除了应用于检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用外，还可以检测蛋白质与核酸或其他生物大分子之间的相互作用，并能对整个反应过程进行实时监测。

2.6 生物信息学分析 生物信息学(bioinformatics)是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科，是以理解各种数据的生物学意义为目的，运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学[13]。生物信息学在基因组学和蛋白质组学的研究中起着特殊的重要作用，因为基因组和蛋白质组研究提供的数据数量之大在生物学史上是史无前例的。当前，生物信息学不但可以高效地进行基因组和蛋白质组数据的分析，而且还可以对已知或新的基因产物进行全面的功能分析。例如，用生物信息学对质谱得到的肽指纹图谱(peptide-mass fingerprinting)的分析获得了一个新的在进化过程中保守的模序(motif)，它对蛋白质的结构和功能具有重要意义。虽然产生在计算机技术基础上的生物信息还存在着计算方法的局限性和自动推理的不完善性，使通过计算机所获得的生物知识还不可能完全视为规律，而有待回到真实的细胞组织内进行验证，但可以肯定的是，随着生物信息学成为后基因组的中心主题，蛋白质信息学也将成为蛋白质组学中最有活力的新领域。

3 展望

当前，虽然蛋白质组研究还处于初期发展阶段，相关技术手段及其配套应用还很不成熟，但是其受重视的程度和进展还是显著的。我国于1997年设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立”，1999年由中国科学院上海生化研究所等多家单位联合组成课题组，启动了国家重点基础研究发展规划项目“人类重大疾病的蛋白质组学研究”，2001年，由北京9家高校、科研单位联合组建成立了蛋白质组学研究院，其研究的主要对象之一就是严重威胁我国人口健康的肝病。从蛋白质组学这个研究领域诞生以来，基础研究和实际应用的期望就表现出强烈结合的趋势。

随着蛋白质鉴定技术的发展和生物信息学技术的应用，将会有更多的新蛋白得到分离鉴定，从而得到更多与疾病相关的分子标记物，也能为相关药物研究提供更多候选靶标。

(*通信作者)