一株斑点叉尾源爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验

2018-11-28黄小丽陈家荣

水产科学 2018年6期

樊威，贺扬，黄小丽，王均，吴俊，苏建，陈家荣，蒋鑫，王俊

( 1.四川省内江市农业科学院水产研究所，四川内江 641000； 2.内江师范学院生命科学学院，四川内江 641000； 3.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130； 4.四川省水产局，四川成都 610000 )

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

主要试剂和药品：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉[Oxoid公司(中国)]，DNA Marker、细菌DNA基因组提取试剂盒、2×Taq Master Mix[天根生化科技(北京)有限公司]；细菌生化微量鉴定管、氧化酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、吲哚、H2S、阿拉伯糖、卫矛醇、V-P、DNase、药敏纸片等(杭州微生物试剂有限公司)。

1.2 病症观察

1.3 病原菌的分离和培养

在无菌状态下，对病鱼肝、肾和脾进行细菌分离，将其接种于LB琼脂平板，28 ℃培养24 h。挑取单个优势菌落进行细菌的分离纯化后，进行细菌形态特征记录并进行鉴定。

1.4 病原菌的16S rRNA鉴定

将纯化的细菌接种于10 mL LB液体培养基中，培养过夜。收集菌体，按照DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，使用细菌16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增序列经琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。序列结果提交美国国立生物技术信息中心进行序列比对，并运用邻接法构建系统进化树。鉴定的细菌置于-20 ℃保存。

1.5 微量生物化学鉴定

根据PCR鉴定及系统进化树的结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[7]和《一般细菌常用鉴定方法》[8]中的方法进行细菌的二次鉴定。采用细菌生化微量鉴定管法系统测定分离菌株生化特性，28 ℃恒温箱中培养24 h，进行葡萄糖、阿拉伯糖、吲哚、氧化酶、卫矛醇、V-P反应和精氨酸双水解酶等生化试验。

1.6 动物回归感染试验

1.7 药敏试验

将纯化的细菌接种于10 mL LB液体培养基中，培养过夜。采用K-B纸片扩散法[9]，在超净工作台中将200 μL试验菌液用灭菌涂布棒平铺于LB琼脂培养基上，盖上培养皿盖后置室温干燥3～5 min，用镊子将药敏纸片贴于平板表面并适当按压，每个培养基表面贴5张各种药敏试纸，4张均匀地贴在离培养皿边缘15 mm处，一张位于中心。随后将培养皿倒扣置于恒温箱内，28 ℃培养16～18 h。测量抑菌圈直径，根据药敏纸片厂家推荐的抑菌范围判断结果。