礁膜室内规模化人工育苗的研究

粟 文，谢恩义，孙立伟，王艳平，王 惠，徐日升

( 广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088 )

礁膜(Monostromanitidium)又名绿紫菜，属绿藻门、石莼目、礁膜科、礁膜属，是冬、春季大型海藻，为一层细胞组成的膜状体，黏滑，基部细胞向下延伸出假根丝组成固着器，成熟时产生雌、雄配子，配子结合为合子，并生长发育成孢子体。孢子体小型，囊球状，孢子囊成熟后可产生有4条鞭毛的游孢子[1]。研究发现，礁膜营养丰富，含有较高的蛋白质、碳水化合物及多种维生素和矿质元素，口感好，食用价值高，并具有药用价值，有清热化痰、利水解毒、软坚散结的作用，常用于治疗喉炎、咳嗽痰结、水肿等[2-4]；从中提取的硫酸多糖有抗凝血、抗氧化、降血脂和抗炎活性[5-6]，因此，礁膜是一种极具开发潜力的海洋食品、药物和化妆品等资源。虽然国内对绿藻的开发利用呈现上升的趋势，浙江等地已形成了一定规模的绿藻加工产业，但产量还远远不能满足国内外的需求[7-8]。因此开展绿藻栽培种——礁膜的人工育苗技术的研究具有重要意义。

20世纪90年代，日本Kida[9]较早完成了礁膜的人工育苗与栽培技术，日本礁膜的产业化已经比较完善，栽培技术处于领先水平。随后，国内陈昌生等[10-12]研究了生态因子对礁膜配子和合子的影响；Hua等[13]研究了宽礁膜(M.latissimum)的生活史；谢恩义等[14]对宽礁膜的基础生物学及室内育苗与栽培进行了较全面的研究；李晓丽等[15]对北极礁膜(M.arcticum)进行了合子采苗、孢子囊培养和孢子采苗等人工育苗试验。这些研究多侧重于基础研究，虽然有过人工育苗的尝试，但均未达到规模化育苗的要求。要发展我国礁膜栽培业，首先需要建立室内人工育苗技术，笔者对广东地区礁膜进行了配子放散、合子附着与培养等相关试验，旨在建立一套我国礁膜室内人工大规模育苗技术。

1 材料与方法

1.1 种藻来源

礁膜种藻于2016年3月至4月下旬采自广东湛江硇洲岛附近海域的中高潮带，藻体加冰低温运输带回实验室，用消毒海水(经砂滤及暗沉淀处理的自然海水煮沸消毒20 min，冷却至常温)清洗去除藻体表面的泥沙和杂藻。

1.2 成熟礁膜配子日放散规律

挑选藻体颜色为黄褐色，镜检边缘有一圈成熟配子囊的种藻，吸干藻体表面水分，取1 g种藻放入培养皿中加入20 mL消毒海水(盐度27)，置于有自然光的恒温室内(24±0.5) ℃，连续观察24 h，每隔2 h用移液枪取25 μL配子液移至载玻片上，根据盖玻片与视野面积之比，求出盖玻片下的视野数(即25 μL配子液的配子数量)，从而计算出 20 mL中配子放散量。每次观察后同时清洗藻体并更换消毒海水。

1.3 合子附着

黑暗时间对合子附着的影响：设置8个直径为6 cm培养皿，每个培养皿放入3块2 cm×2 cm×1 mm PVC苗板，倒入相同量配子液，置于黑暗处连续培养16 h[12-13]，每隔2 h取出1个培养皿，显微镜下(10×10)观察合子附着数，根据苗板面积与视野面积之比，计算出每块苗板的合子附着总数，取均值。

不同附着基对合子附着的影响：将PVC塑料板、PET塑料板、纤维板、普通玻璃板和有机玻璃板5种不同材料2 cm×2 cm×1 mm的苗板分别放入5个直径为6 cm培养皿，每个培养皿3块相同材料苗板，置于黑暗处12 h后同上计算苗板合子附着总数。

1.4 合子培养中杂藻硅藻的清除

用内径0.48 cm的钻孔器取硅藻附着基本一致的苗板圆片，放入200 mL消毒海水中，二氧化锗质量浓度梯度设置为0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、20、30、40 mg/L。显微镜下(10×10)观察各圆片附着的硅藻数，计算出二氧化锗对附着硅藻处理后的脱落率或增长率。

1.5 礁膜室内人工育苗试验

配子放散：将清洗干净的种藻均匀铺于干净通风处阴干10～16 h(种藻含水量50%～60%)，称量0.9 kg放入40 L消毒海水中(盐度27、温度24 ℃)，充气搅拌，用光照度为5×104～9×104lx的强光照射，约5 min后加入适量45 ℃蒸馏水[13]，约30 min后用筛绢过滤出种藻即得配子液。同上计算配子放散总量。

合子附着与培养：将200张PVC苗板浸入40 L配子液中，黑暗处理12 h，合子附于PVC苗板后(同上计算合子附着总数)分置于4个塑料水槽中培养，水容积180 L，每个月更换消毒海水1～2次。培养期间，每隔5 d测1次水温、盐度、光照和合子直径，每次测量20个合子，取其平均值。

采集游孢子及培育：游孢子采苗使用的附着基为维尼纶绳(海区栽培多采用苗绳，直径1 cm)。采游孢子时,将生长成熟孢子囊的PVC苗板移入消毒海水中，强光照射(5×104～9×104lx)，经搅拌待大量游孢子放出，水色变为浅绿色时，取出PVC苗板，放入维尼龙绳，浸泡、翻动，待游孢子附着后移至塑料水槽内培养，水容积180 L。

1.6 数据统计及分析

数据采用Excel 2007和SPSS 16.0软件进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，取P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。

2 结 果

2.1 成熟礁膜配子日放散规律

3月初即将成熟的礁膜，在室内适宜条件下暂养约4 d，藻体边缘颜色由绿色变成黄褐色，配子囊迅速成熟。镜检可见在成熟的配子囊放散配子前，囊壁变成透明状，极易吸水破裂，配子即从裂口喷射而出。8:00—12:00配子放散量较少，14:00配子放散量较多，18:00—2:00配子放散量基本不变，4:00和6:00出现一个放散小高峰期，且在4:00时候配子放散量最高(图1)。礁膜24 h昼夜均能进行配子放散，因此室内规模化人工育苗时可在较为方便的任何时间段进行采苗。

图1 礁膜配子的日放散规律

2.2 合子附着

黑暗时间对合子附着的影响见图2。由图2可知，黑暗2～16 h均有合子附着，但黑暗时间短(2～6 h)，合子附着密度低；随着黑暗时间的延长合子附着密度迅速增加，黑暗第8 h，合子的附着数达到最高，为8.7×105个。黑暗时间继续延长，合子附着数逐渐下降，到第14 h时苗板合子附着数仅约为第8 h的65%。t检验表明，黑暗8～12 h间合子附着数无显著差异(P>0.05)。

图2 黑暗时间对合子附着的影响

不同材料的苗板对合子附着的影响见图3。由图3可知，黑暗处理12 h，合子均能很好地附着于5种材料苗板上，合子附着数为3.4×105～3.8×105个。t检验表明，5种材料苗板之间的合子附着数不存在显著差异(P>0.05)。

图3 不同材料的苗板对合子附着的影响

2.3 合子培养中硅藻的清除

二氧化锗清除硅藻的效果见表1。随着二氧化锗质量浓度的增加和处理时间的延长，硅藻脱落呈现递增趋势。当二氧化锗质量浓度大于0.5 mg/L时，对附生硅藻的脱落作用显著；当二氧化锗质量浓度达3 mg/L时，苗板圆片上附生的硅藻在第11 d全部脱落。处理后的苗板圆片移至消毒海水继续培养20 d，镜检合子正常生长。

2.4 礁膜室内人工育苗

配子放散时可观察到大量配子聚集在一起成云雾状，海水变为浅绿色，配子放散总数达4×1010个，平均每克藻体放散配子量高达4.4×108个。合子的培养条件及生长见表2。礁膜合子培养时间自4月中旬至9月中旬，历时约5个月。合子培养前期(4—6月)，水温较低，生长较快，合子由5.2 μm增至39 μm，6月下旬，镜检合子内形成颗粒状的游孢子，转为孢子囊。7—8月水温较高，孢子囊生长缓慢，9月上旬进行遮光处理，以促使孢子囊同步成熟。附着于维尼纶绳上的游孢子，培育15 d后可生长至长度为1 cm的礁膜幼苗。

表1 二氧化锗去除硅藻的效果

表2 合子的培养条件及生长

3 讨 论

礁膜室内人工育苗技术能有效解决大面积推广所需礁膜种藻的问题，缓解种质退化，为礁膜的规模化人工育苗及栽培提供技术支撑。根据多次采集种藻进行配子放散试验发现，在礁膜繁殖盛期3月下旬至4月下旬期间的大潮前后可采集到成熟度较好的种藻，用于生产性育苗。根据礁膜属已有的人工育苗研究[13-15]以及试验可知，对种藻进行室内阴干刺激处理10～16 h，在采配子过程中充气搅拌、强光照射、改变海水温度(±2～3 ℃为宜)和盐度(±3～5为宜)能一定程度促使配子集中大量放散。

Kida[9]将附着板打孔穿绳后，采用悬挂式方法进行合子附着和培养。本试验采用插槽式方法进行合子附着和培养，能极大提高育苗效率，且便于操作管理。规模化人工育苗建议选用经砂轮打磨过的PVC塑料板作为苗板，便于在5个月的合子、孢子囊培养期里在显微镜下随时观察记录其生长情况，苗板不宜过大，建议规格为20 cm×10 cm×1 mm。礁膜配子具趋光性，进行合子附着黑暗处理能使合子较均匀附着于苗板上，且能增加配子结合成合子的几率[16]，但初生合子抗逆性弱，长久得不到光照，生长会受抑制，甚至死亡。本研究采用PVC苗板作为附着基，黑暗8～12 h时合子附着效率最高，这与陈昌生[11]直接采用培养皿为附着基黑暗10 h合子附着率达到最大的试验结果相接近。合子在转为孢子囊前光照度不能长期低于900 lx，超过2～3 d合子会迅速死亡。培养过程中苗板上极易滋长蓝藻、绿藻和硅藻等杂藻，杂藻大量生长，抢占、替代合子生态位点，或释放孢子萌发成小苗而覆盖合子[13]，进而导致合子死亡。用0.5～3 mg/L二氧化锗处理11 d能有效去除合子培养过程中滋生的硅藻，蓝藻和绿藻可采用干燥的方法抑制其着生，但无法彻底根除，且繁殖速度极快。合子、孢子囊的培养期有5个月，培育效果直接影响到礁膜人工育苗的成败，因此亟待进一步从根本上解决杂藻生长引起的合子死亡的问题。

图4 礁膜室内人工育苗a.种藻室内阴干10～16 h；b.种藻放入消毒过滤海水中，采用充气搅拌、强光照射等方法促进配子放散；c.将种藻滤出后的配子液；d.将PVC苗板浸入配子液中；e.黑暗处理8～12 h，使雌、雄配子结合成合子附着于PVC苗板上；f.附有合子的PVC苗板；g.附于PVC苗板上的合子(10×10)；h.室内合子培养；i.孢子囊释放游孢子(10×10)；j.培育15 d长度为1 cm的礁膜幼苗(4×10).