CRMP-1在早发型先兆子痫妇女胎盘中的表达水平及临床意义

袁银花，冯双苗，张化莲

(驻马店市中心医院 产二科，河南 驻马店463000)

先兆子痫是一种以高血压和蛋白尿为主要特征的妊娠期特异性疾病，其多发于妊娠20周后，是造成我国孕产妇及围生儿死亡主要原因之一[1]。发生于孕34周前的先兆子痫称为早发型先兆子痫，其母婴的并发症发生率较高，应引起广泛重视[2]。目前，有关先兆子痫的发病机制尚未形成完整阐述，但普遍认为血管内皮损伤和胎盘胎血是造成先兆子痫发生的根源，近年来对先兆子痫孕妇胎盘的组织学检查结果发现，患者胎盘滋养层存在异常侵袭、滋养层细胞存在凋亡现象[3]。坍塌反应调节蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1)是一种磷酸化糖蛋白，研究表明其参与肿瘤细胞侵袭转移，滋养层细胞浸润与肿瘤细胞侵袭行为较为相似，但目前鲜少有CRMP-1在先兆子痫胎盘组织中的相关报道[4]。因此，本研究旨在探讨CRMP-1在不同类型先兆子痫孕妇胎盘组织中的表达水平，为后期该类疾病的临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年1月-2017年6月在本院住院的先兆子痫孕妇60例作为研究对象，其中早发型先兆子痫孕妇30例(发病孕周<34周)，迟发型先兆子痫孕妇30例(发病孕周≥34周)，所有孕妇均符合乐杰主编《妇产科学》第7版的相关标准[5]，并经院伦理委员会批准，排除糖尿病、原发高血压、自身免疫系统疾病等。另选取不同阶段终止妊娠或剖宫产的健康孕妇60例作为对照组，其中妊娠前期组20例(孕5-13周)因社会因素、胎位异常等自愿选择手术终止妊娠；妊娠中期组11例(孕14-27周)因宫颈无力、产道异常选择终止妊娠；妊娠晚期29例(≥28周)行剖宫产。并通过妊娠孕周匹配从健康孕妇中分别选取早发型先兆子痫和迟发型先兆子痫的对照组。各组孕妇的年龄、产次、孕次比较，差异均无统计学意义，见表1。

表1 各组孕妇一般资料比较

1.2 试剂与仪器

兔抗人CRMP-1抗体购自上海希美生物科技有限公司；SP-9710试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。石蜡切片机、包埋机、摊片机、烘片机均购自德国Leica公司；光学显微镜购自日本Olypus公司。

1.3 方法

1.3.1标本采集

在分娩室或手术室收集胎盘，在中央小叶取1.0 cm*1.0 cm*1.5 cm的组织块，采用无菌生理盐水冲洗后置入福尔马林中固定，并将胎盘组织依次置于70%、90%、95%、100%浓度的乙醇中进行梯度脱水，置入二甲苯中两次进行透明，将组织浸蜡，放入包埋框中进行包埋，并保存于-20℃冰箱中备用。

1.3.2免疫组化检测

采用免疫组化法对胎盘组织CRMP-1进行检测，具体步骤如下：①将蜡块切成厚度为5 μm的切片，展片、烘烤固定；②将切片进行常规脱蜡，置入不同浓度乙醇中进行梯度脱蜡水化；③无菌磷酸盐换冲液(PBS)冲洗切片3次，滴加3%过氧化氢室温处理10 min以灭活内源性酶；③PBS洗片，滴加山羊血清进行室温封闭30 min；④弃掉封闭液，加入按照说明书比例稀释的CRMP-1抗体，4℃孵育过夜；⑤PBS洗涤3次，滴加HRP标记的二抗室温孵育10-15 min；⑥PBS洗片后，进行DAB显色，蒸馏水终止显色，采用苏木素复燃核，1%盐酸酒精分化数秒后，流水冲洗返蓝；⑦滴度酒精脱水后，采用二甲苯透明，滴加中性树胶封片，在显微镜下进行观察拍照。

1.3.3结果判定

参照文献[6]，采用阳性细胞所占比例和染色强度双评分半定量法对免疫组化阳性结果进行判定，染色强度评分：0分为无着色，1分为轻染色、浅黄色，2分为中染色、棕黄色，3分为强染色、棕褐色；阳性细胞所占比例评分：0分表示<25%，1分表示25%-50%，2分表示50%-75%，3分表示>75%。每个标本随机取3个不同视野进行评分，最终取平均值，按照染色强度与阳性细胞百分比的和评定阳性程度：阴性(-)为≤1分；弱阳性(+)为12分；中等阳性(++)为3-4分 ；强阳性(+++)为5-6分。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0软件进行统计分析，计数资料以[n(%)]表示，组间比较采用检验，等级资料比较采用秩和检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常妊娠组妇女不同妊娠阶段胎盘组织中CRMP-1的表达

CRMP-1定位于滋养细胞的胞浆，其着色呈黄色。正常妊娠组妇女胎盘组织中CRMP-1的蛋白表达水平随着妊娠周期的增加呈下降趋势，组间差异有统计学意义(Uc=28.508，P=0.000)；其中妊娠早期组妇女者胎盘组织强阳性表达率明显高于妊娠晚期组，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 正常妊娠组妇女不同妊娠阶段胎盘组织中CRMP-1的表达强度比较[n(%)]

注：与妊娠早期组比较，*P<0.05；与妊娠中期组比较，#P<0.05。

2.2 早发型先兆子痫妇女胎盘组织中CRMP-1的表达

早发型先兆子痫组妇女胎盘组织CRMP-1表达水平明显高于同阶段正常妊娠对照组妇女，差异有统计学意义(Uc=8.866，P=0.031)。见表3。

图1 不同妊娠阶段孕妇胎盘组织CRMP-1表达情况(200×)

组别n-++++++对照组A198(42.11)6(31.58)4(21.05)1(5.26)早发型先兆子痫组303(10.00)9(30.00)10(33.33)8(26.67)

2.3 不同严重程度早发型先兆子痫妇女胎盘组织中CRMP-1表达水平比较

早发型先兆子痫轻度组和重度组妇女胎盘组织中CRMP-1水平比较，差异无统计学意义(Uc=2.963，P=0.397)。见表4、图2。

表4 不同严重程度早发型先兆子痫组妇女胎盘组织中CRMP-1表达水平比较

图2 早发型先兆子痫不同严重程度孕妇胎盘组织CRMP-1表达情况(200×)

2.4 迟发型先兆子痫妇女胎盘组织中CRMP-1的表达

迟发型先兆子痫组妇女胎盘组织CRMP-1表达水平与同阶段正常妊娠对照组比较，差异无统计学意义(Uc=2.987，P=0.225)。见表5。

表5 迟发型先兆子痫组与同阶段正常妊娠组妇女胎盘组织中CRMP-1表达水平比较

2.5 早发型先兆子痫与迟发型先兆子痫组妇女胎盘组织中CRMP-1表达水平比较

早发型先兆子痫组妇女胎盘组织中CRMP-1水平明显高于迟发型先兆子痫组，差异有统计学意义(Uc=18.561，P=0.000)。见表6、图3。

表6 早发型先兆子痫组与迟发型先兆子痫组妇女胎盘组织中CRMP-1表达水平比较

图3早发型先兆子痫与迟发型先兆子痫组妇女胎盘组织中CRMP-1表达情况(200×)

3 讨论

先兆子痫又称子痫前期，根据发病时间以妊娠34周作为分界将其划分为早发型先兆子痫和迟发型先兆子痫。近年来，临床研究表明两种先兆子痫类型的发病机制可能存在较大差别，可能属于同一疾病不同生理阶段的独立存在体[7]。迟发型先兆子痫的发生率约占先兆子痫的80%，患者胎盘的形态学类似于健康妊娠者，多伴有胎儿生长受限，但对其影响相对较小，且随着妊娠终止或产后多数孕妇的临床症状及生化指标会逐渐恢复[8]。而早发型先兆子痫的发生率虽然远低于迟发型先兆子痫，但其妊娠早中期即出现蛋白尿、高血压症状，多伴有胎盘绒毛发育及血管形态的异常，病情更为严重，患者并发症发生率远高于迟发型先兆子痫，且对产妇的预后影响较大[9,10]。因此，探寻早发型先兆子痫的特异标志物对该类疾病的及早诊断及靶向治疗意义重大。

CRMP-1属于CRMP家族成员，是RAS抑癌基因下游蛋白Rho GTP酶的作用底物，主要存在于细胞膜内侧与脂筏结构偶联，通过调节微管聚合或解散，参与细胞骨架形成，调节细胞凋亡、分化、突起的坍塌等生物行为。CRMP-1最初发现于脑组织，被认为是脑特异性蛋白质，其在神经元树突发育及形态构建中发挥重要作用，研究表明其表达失调与癫痫发作具有密切相关性[11]。近年来有研究发现CRMP-1能够抑制肿瘤细胞侵袭、转移，其在癌组织中呈低表达，但其具体机制尚不清楚[12]。滋养层细胞来自胚胎，其具有与恶性肿瘤类似的高增殖和侵袭能力，滋养细胞的浸润在妊娠早期胎盘植入、胎盘血管重塑及维持正常妊娠中发挥重要作用，推测CRMP-1可能在病理妊娠中发挥一定作用。

滋养细胞侵入到子宫脱膜进而侵入至子宫浅肌层，部分绒毛外滋养细胞侵入至血管内，诱导血管内皮细胞凋亡并取代血管内皮细胞，与血管周围滋养细胞联合，在扩大血管内径的同时，使子宫螺旋动脉重塑，维持正常妊娠[13,14]。本研究指出CRMP-1在妊娠胎盘的滋养层细胞中亦有表达，可能调节胎盘滋养细胞分化，介导胎盘植入。Lyall等[15]研究表明滋养细胞侵入障碍导致子宫胎盘螺旋动脉重塑受阻，进而导致子宫螺旋动脉管腔狭小，造成胎盘血流灌注量减少，与先兆子痫及胎儿生长受限的发生具有密切相关性。但目前极少有CRMP-1与先兆子痫相关病理机制的报道。本研究发现CRMP-1在正常妊娠及先兆子痫患者的胎盘滋养层中均有表达，其中妊娠早期胎盘组织中的表达水平较高，随着妊娠周期的增长逐渐下降，同时观察到早发型先兆子痫组孕妇胎盘组织CRMP-1表达水平明显高于同妊娠阶段健康孕妇，但在迟发型先兆子痫组并未观察到CRMP-1与同妊娠阶段健康孕妇的表达差异。提示CRMP-1的上调可能提高早发型先兆子痫的发生概率。但本研究另观察到早发型先兆子痫轻度组与重度组患者胎盘组织中CRMP-1表达情况并无显著差异，表明CRMP-1在早发型先兆子痫中的表达水平与疾病进展并无确切联系，可能由于先兆子痫患者在妊娠早期阶段滋养细胞浸润过程中已存在CRMP-1蛋白的表达异常，进而影响胎盘着床及螺旋动脉血管重塑，而疾病后期发展过程中病情的加重可能是由其它因素造成的。

综上所述，CRMP-1蛋白在妊娠阶段胎盘滋养浸润过程中发挥重要作用，其表达上调可导致滋养层细胞侵入受阻，进而使子宫螺旋动脉重塑发生障碍，导致早发型先兆子痫的发生，但其与迟发型先兆子痫的发生无确切相关性，具体作用机制有待后期进一步深入研究。