氧化石墨烯的制备、表征及其抗菌性能研究

张 鑫，施欢贤，任映坤

(1.陕西中医药大学药学院，咸阳 712046；2.西北大学化工学院，西安 710069)

石墨烯是由碳原子以sp2杂化形成的六元环状网型结构的二维晶体[1]。石墨烯不溶于水且在常见有机溶剂中的分散性弱，因此限制了其在生物医药领域的应用[2]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯重要的衍生物之一，实验室中一般通过强酸氧化石墨制备GO[3]，GO是一个或几个原子层厚度的石墨烯，其片层上下表面接有环氧基和羟基，边缘为羟基、羰基及羧基[3-4]，因此，GO除了保留石墨烯的一些优异特性如6个碳原子的骨架以及巨大的比表面积之外，具有亲水性的羟基和羧基，水溶性明显优于石墨烯[5]，含氧活性基团的存在提高了GO的表面活性并易于修饰[6-7]，使其在生物医药领域中有更广泛的应用[8-10]。其中石墨烯基材料的抗菌应用也不断被报道，如Au、Cu、Ag、Pt[11]、ZnO[12]、壳聚糖和抗生素等[13]，以及以GO为基底的纳米材料复合物(如GO-Ag[14]、GO-ZnO[12]、GO-聚赖氨酸[15]、GO-抗生素[16]等)也有报道，而单独氧化石墨烯在抗菌方面的应用也是非常值得研究的。氧化石墨烯的结构见图1。

本文以膨胀石墨粉为原料，采用改进的Hummers多步法制备GO，并对其进行形貌和光谱学表征，然后以制备的GO为抗菌材料，选取大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌探讨GO的抗菌性能，并结合扫描电镜探讨GO对2种细菌的抗菌机理，以期为研制新的、高效安全的GO复合型抗菌剂提供依据。

图1氧化石墨烯的结构

Fig.1 The structure of GO

1 仪器与试药

1.1仪器 BS224S分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]； DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；GL-20G-Ⅱ离心机，恒温THZ-320振荡器(上海安亭科学仪器厂)；KQ-300E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Thermo Scientific Multiskan热电FC酶标仪(美国Multiskan FC公司)。

1.2试药 膨胀石墨粉(graphite，Gt)、高锰酸钾、氯化钡、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(西陇化工股份有限公司)；硫酸(西安化学试剂厂)；氯化钠(天津天力化学试剂有限公司)。以上化学试剂均为分析纯及以上级别。生理盐水(河北天成药业股份有限公司)；琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物(北京奥博星生物技术有限责任公司)，均为分子生化级。

2 方法

2.1GO的制备 采用改进的Hummers法、以Gt为原料多步制备GO[3-4]。具体过程：低温阶段，将含有100 mL质量分数为98%的硫酸烧瓶置于冰浴中，在搅拌下向瓶中缓慢加入3 g Gt，之后加入高锰酸钾12 g，搅拌并保持不高于4 ℃反应20 min，直至溶液变为墨绿色，用15 ℃水对反应体系水浴2 h；中温阶段，反应体系经35 ℃水浴温热40 min并不断搅拌，得到墨绿色的悬浮液，同时瓶壁上有紫色沉淀；高温阶段，向反应体系中缓慢加入高纯水220 mL，期间温度控制在80 ℃，并保持20 min；反应结束后向体系中加入高纯水至总体积600 mL，并控制温度45 ℃，缓慢滴加体积分数为30%的过氧化氢10 mL，混合液不断有气泡冒出，由褐色变为黄色，反应10 min后，混合液全部变为金黄色丝光状胶体，静置24 h，抽滤，下层沉淀物用质量分数为5%的盐酸反复洗涤，至检测无氯化钡白色沉淀出现。所得沉淀用高纯水洗涤，以8 000 r·min-1离心，重复洗涤、离心，至洗涤液pH值接近7，最后将沉淀置于真空干燥箱中，于60 ℃烘干，即得干燥的氧化石墨。

将一定量的氧化石墨加入到一定体积的超纯水中，超声使其溶解分散均匀，即得溶液及GO分散液。

2.2抗菌实验 LB培养基的准备：酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL(pH:7.0～7.2)，121 ℃高压灭菌20 min。固体培养基：液体培养基中加入琼脂20 g。

抗菌实验：采用大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)作为实验菌种，根据国标法使用平板计数方法计数和统计抗菌率[17]，整个操作过程均在无菌条件下进行。取处于对数生长期的大肠埃希氏菌菌液(≈107cfu·mL-1)10 mL，置于离心机中以6 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，下层菌种重悬于50 mL生理盐水中，用酶标仪测定其在600 nm处的吸光度值约0.2时方可进行后续实验。取菌悬液0.5 mL，用生理盐水逐次稀释1 000倍，取稀释液80 μL涂布，作为空白对照组。向剩余菌悬液中加入灭过菌的一定量的 GO分散液，于室温下磁力搅拌，分别在抗菌实验进行到不同时间各取反应液0.5 mL，用生理盐水逐次稀释1 000倍，取稀释液80 μL涂布。涂布后的培养皿放入37 ℃恒温箱中培养20 h，观察每个培养皿中大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌落的分布，用平板计数法计数，GO抗菌率的计算采用以下公式[17]。

R=(B-C)/C×100%

其中R为抗菌率(%)，B为空白对照组在实验结束后样品中细菌的平均存活数(cfu·mL-1)，C为实验结束后样品中细菌的平均存活数(cfu·mL-1)。

2.3分析方法 GO的形貌和结构用Carl Zeiss SIGMA扫描电子显微镜SEM(德国Zeiss公司)和Rigaku D/MAX 3CX-射线粉末衍射仪XRD(日本理学X射线衍射仪)分析、表面官能团用PerkineElmer-650傅里叶红外变换仪(美国PerkineElmer公司)分析；抗菌前后细菌形态的变化用扫描电子显微镜分析。

3 结果与讨论

3.1GO的表征 膨胀石墨粉和氧化石墨烯的形貌见图2。其中图2A是Gt的SEM图，可观察到其表面平整、呈片层状结构、且层层堆积在一起；图2B是GO的SEM图，其表面不平整、褶皱较多、层与层之间明显分开，说明环氧基和羟基等已成功插入到GO表面，增大了层间距，证明膨胀石墨基本转化成氧化石墨烯。

图2SEM照片

A.Gt；B.GO。

Fig.2 The SEM images

A．Gt;；B.GO.

图3样品的XRD和FTIR谱图

A．XRD；B.FTIR。

Fig.3 The XRD and FTIR spectra of Gt and GO

A．XRD；B.FTIR.

Gt和GO的XRD谱图见图3A，从图中可知Gt在2θ 26.5°的峰对应石墨(002)晶面，是Gt的特征衍射峰[3]；GO在10.8°处的衍射峰对应石墨烯(001)晶面[4]，是GO的特征衍射峰，由此可知，Gt被氧化后，26.5°处的衍射峰几乎消失，说明Gt已基本转化为GO。膨胀石墨粉和氧化石墨烯的FTIR光谱见图3B，Gt在4 000～650 cm-1波数范围内没有明显的吸收峰；对于GO，在3 500～3 000 cm-1出现的宽而强的吸收带对应的是-OH的氢氧伸缩振动峰，1 720 cm-1处的峰是C=C双键的伸缩振动峰，1 624和1 030 cm-1处的吸收峰分别是由石墨粉氧化而来的羰基、烷氧基的伸缩振动峰[8]，说明Gt已氧化成GO。

3.2GO的抗菌性能分析 将质量浓度为0.2 mg·mL-1的GO分别加入到A600处浊度为0.2的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生理盐水50 mL中，2种细菌在固体培养基上形成的菌落分布随时间变化的照片见图4。大肠埃希氏菌与GO混合后，细菌就开始失活，进行到30 min时，大肠埃希菌的菌落数明显减少、存活率降低，进行到1 h GO的抗菌率可达99.8%以上；对于金黄色葡萄球菌，在2 h内细菌的菌落数变化不大，进行到3 h能观察到菌落数减小、细菌存活率下降，直至4 h菌落密度明显减小，此时 GO对金黄色葡萄球菌的抗菌率达65%。对比上下2组图表明，GO对大肠埃希氏菌的抗菌效果较好。

图42种细菌的菌落及存活率随时间的变化图(E为大肠杆菌组，S为金黄色葡萄球菌组)

Fig.4 The changes of the colony formed and their survival rate with time(E and S are the groups ofEscherichiacoliandStaphylococcusaureusrespectively)

2种细菌形态变化的SEM图见图5。图5A和5B分别是对照组和加入GO 1 h后的大肠杆菌图片，可观察到对照组大肠杆菌的形态饱满、荚膜清晰可见，而实验组图5B明显可见菌体表面粗糙、且边界处有细胞内容物泄漏；图5C和5D是对照组和加入GO 4 h 后的金黄色葡萄球菌，对照组中细菌呈球状、荚膜清晰，实验组中的金黄色葡萄球菌则出现了萎缩，且部分细菌荚膜已被破坏，细菌失活。由于金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖层厚于大肠埃希菌[18]，即前者的细胞壁厚于后者，可有效抵御GO对细菌的破坏，这种破坏包括GO锋利的边缘对细胞膜的划伤[18]、氧化应激引起的生物膜破裂[19]以及GO对细胞膜中磷脂分子的抽提[20]，均能引起细菌死亡，所以GO对大肠埃希菌的抗菌能力要优于金黄色葡萄球菌。但以GO为基底的复合材料可能会改善GO在抗菌方面的不足，因此GO复合功能材料将会成为抗菌材料研制中的新希望。

图5抗菌前后2种细菌的形态

A和B.对照组和抗菌1 h的大肠埃希氏菌；C和D.对照组和抗菌4 h的金黄色葡萄球菌。

Fig.5 The SEM images of the 2 bacteria

A and B.Escherichiacoli；C and D.Staphylococcusaureus.

4 结论

以膨胀石墨粉为原料，采用改进的Hummers方法，通过多步制备了氧化石墨烯。SEM、XRD和FTIR表征结果证实了GO表面褶皱多、较薄，具有石墨烯(001)晶面的结构组成，且表面有羟基、羧基、羰基和环氧基。评价了GO对大肠埃希氏菌(G+)和金黄色葡萄球菌(G-)的抗菌性能。结果表明，0.2 mg·mL-1GO分别与大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌液107cfu·mL-1作用1和4 h，其抗菌率分别可达到99%和65%，对大肠埃希氏菌的抗菌效果较好。