丹红益脑膏的质量标准研究
2018-11-24卫向锋牛春玲孙婷婷党秋萍刘建峰
卫向锋,霍 花,牛春玲,张 艳,郑 倩,张 红,孙婷婷,党秋萍,刘建峰
(1.西安中医脑病医院,西安 710032;2.沈阳军区总医院北方医院,沈阳 110034;3.陕西省中医药研究院中药研究所,西安 710031)
丹红益脑膏是西安中医脑病医院院内制剂,在临床上使用已10多年,该处方由猪牙皂、丹参、红花和冰片等7味药材组成。红花活血化瘀、通经止痛[1];猪牙皂可祛痰、开窍,为君药[2];丹参活血祛瘀止痛、清心除烦[3];胆南星为辛凉之品,可熄风定惊、清热化痰[4];艾叶散寒止痛,取其外用温熙气血、透达经络,为臣药[5]。石菖蒲醒神益智、开窍豁痰;冰片开窍醒神、通行十二经,其中冰片又可引诸药达脑窍,兼为方中使药[6]。药理研究证明,丹红益脑膏能改善或恢复病理状态下的血液黏度、促进脑脊液循环,还能改善毛细血管通透性,促进脑脊液吸收;并能调节脉络丛功能,抑制脑脊液分泌;减轻感染等引发的脑组织黏连[7-10]。为保证该制剂临床使用有效、制剂质量稳定,采用TLC法对该制剂中丹参、冰片、猪牙皂和红花进行TLC鉴别,用HPLC法对猪牙皂中有效成分刺囊酸进行含量测定,并在此基础上制定该制剂的质量标准。
1 仪器与试药
1.1仪器 2010AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司);KQ-100超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司);BT25S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.2试药 刺囊酸对照品(北京中科仪友化工技术研究院,批号141113);齐墩果酸、冰片对照品(中国食品药品检定研究院,批号分别为0709-9803,111688-200501);丹红益脑膏(西安中医脑病医院制剂室,250 g·瓶-1)。
2 方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1冰片 精密称取本品1 g,加甲醇20 mL,采用超声法提取30 min,过滤,减压浓缩至5 mL,即得供试品溶液。按照处方比例取不含冰片的阴性对照药材,同法制成阴性样品溶液。再精密称取冰片对照品1 mg,加甲醇1 mL,溶解,作为对照品溶液。采用TLC法进行鉴别,点样量各5 μL,采用硅胶G薄层板;以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1∶2)为展开剂,展开后喷20 mL·L-1香草醛浓硫酸溶液,于105 ℃加热2 min至斑点显色清晰。在供试品色谱中,检出冰片,缺冰片阴性样品无干扰[11-12]。见图1A。
图1TLC图
A:1.样品(批号140901);2.样品(批号140902);3.样品(批号140903);4.冰片对照品(批号111688-200501);5.缺冰片阴性样品。B:1.样品(批号140901);2.样品(批号140902);3.样品(批号140903);4.齐墩果酸对照品(批号0709-9803);5.刺囊酸对照品(批号141113);6.缺猪牙皂阴性样品溶液.
Fig.1 TLC chromatograms
A:1.sample (batch number 140901);2.sample (batch number 140902);3.sample (batch number 140903);4.borneol reference substance (batch number 111688-200501);5.borneol negative samples.B:1.sample (batch number 140901);2.sample (batch number 140902);3.sample (batch number 140903);4.oleanolic acid reference substance (batch number 0709-9803);5.echinacanthic acid reference substance (batch number 141113);6.missing gleditsia sinensis negative sample solution.
2.1.2猪牙皂 精密称取本品1 g,与0.5 g硅藻土拌匀,再加入甲醇20 mL,采用超声法提取30 min,滤过,滤液用水浴低温蒸干,残渣加水20 mL,移至圆底烧瓶中,加入浓盐酸2 mL,100 ℃加热回流30 min,取出,放冷至室温,移至分液漏斗中,用乙醚振摇提取2次,每次20 mL,合并2次提取液,低温挥去溶剂,加甲醇1 mL使溶解,即得供试品溶液。另按照处方比例称取不含猪牙皂的阴性对照药材,同法制成阴性样品溶液。齐墩果酸对照品溶液:加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液。刺囊酸对照品溶液:加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液,作为对照品溶液。采用TLC法进行鉴别,点样量各5 μL,采用硅胶G薄层板,展开剂为三氯甲烷-甲酸-甲醇(20∶0.5∶0.5),展开后喷100 mL·L-1硫酸乙醇溶液,于105 ℃加热2 min至斑点显色清晰。在供试品色谱中,检出齐墩果酸和刺囊酸,缺猪牙皂阴性样品无干扰[13]。见图1B。
2.2样品中刺囊酸的含量测定
2.2.1色谱条件 Diamonsil C18色谱柱;流动相:乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(72∶28);检测波长:215 nm;流速:1 mL·min-1;按照刺囊酸色谱峰计算理论塔板数大于3 000。
2.2.2溶液的制备 对照品溶液:精密称取刺囊酸对照品适量,加甲醇制成质量浓度为1.5 mg·mL-1的对照品溶液,备用。
供试品溶液:取本品适量,精密称取1.0 g,加入0.5 g硅藻土拌匀,再加入甲醇50 mL,超声提取30 min,用提取溶剂补足减失的质量,过滤,精密量取滤液30 mL,低温水浴蒸干,加入200 mL·L-1盐酸20 mL,100 ℃加热水解30 min,取出,冷水冷却,移至分液漏斗中,用乙醚提取4次,每次30 mL,将乙醚液合并,低温水浴蒸干,甲醇溶解,定容至10 mL,即得[14-16]。
阴性对照样品溶液:取除猪牙皂以外的处方中其他药材,按照上述方法制备阴性样品,精密称取适量阴性样品,按照供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。
2.2.3系统适用性实验 在2.2.1项色谱条件下对对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液进行测定,发现供试品溶液中刺囊酸峰分离度好,阴性样品无干扰,故确定流动相比例为乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(72∶28),见图2。
2.2.4线性范围考察 分别精密吸取质量浓度为1.69 mg·mL-1的刺囊酸对照品溶液2,4,6,8和10 μL,测定,绘制标准曲线,得回归方程y=296 458.9x-140 543,r=0.999 9,刺囊酸在3.4~16.9 μg范围内,峰面积值与进样量呈良好的线性关系。
2.2.5精密度实验 精密吸取对照品溶液5 μL,重复进样5次,分别测定其峰面积值,计算得RSD值为0.14%,结果表明,该方法精密度良好。
2.2.6稳定性实验 取样品适量,制备供试品溶液,分别放置0,2,4,6,8和12 h,精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,测定峰面积及含量,结果表明,本样品溶液在12 h内稳定性良好,RSD值为2.34%。
2.2.7重复性实验 取样品适量,制备供试品溶液5份,精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,测定刺囊酸含量均值为11.46 mg·g-1,RSD值为1.97%,结果表明,该方法重复性良好。
2.2.8加样回收率实验 精密称取已知含量(11.46 mg·g-1)的样品6份,置于具塞锥形瓶中,分别加入刺囊酸对照品6.10,6.10,7.88,7.88,9.42和9.42 mg,制备加样回收供试品溶液,各精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,测定,计算回收率,见表1。
图2HPLC图
A.刺囊酸对照品;B.供试品;C.缺猪牙皂阴性对照;1.刺囊酸。
Fig.2 HPLC chromatograms
A.echinocystic acid reference substance;B.sample;C.Gleditsiasinensisnegative control;1.echinocystic acid.
表1刺囊酸回收率实验结果
Tab.1 Recovery test results of echogenic acid
(n=6)
实验结果表明,刺囊酸回收率在95%~100%之间,平均回收率为97.98%,RSD值为0.68%,加样回收率良好。
2.2.9样品测定 分别精密称取3批样品适量,按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,结果见表2。
表2样品含量测定结果
Tab.2 Results of sample content measurement
批号样品质量/g刺囊酸含量/mg·g-1均值/mg·g-13批均值/mg·g-11409011.023 611.0311.1311.231.098 511.231409021.082 510.9511.611.006 312.271409031.091 210.3210.951.012 211.58
3 讨论
脑积水的病机关键为瘀血阻络、脑窍不通、水湿(液)停积,属本虚标实之证[17]。脾肾亏损为本,瘀血内阻、水湿停积为标,且本缓而标急,故治疗当立足于活血通窍、化瘀通络和消肿止痛[18-19]。临床虽有不少治疗的方药制剂,但疗效并不十分满意,本制剂是西安中医脑病医院从水瘀理论出发论治,以提高临床疗效为目的,根据中医辨证论治的理论和实践经临床反复验证总结出的中药复方制剂。主治小儿脑积水91例,与传统中医辨证组37例进行对照,具有良好的治疗效果,显效率达82%,总有效率达96.7%。未发现对肝、肾功能及造血系统的影响,表明该药品使用安全。但由于中药复方制剂质量受采收季节、药材产地等因素影响较大,因此为保证药品临床疗效和质量的稳定性,我们采用TLC、HPLC等方法研究制定质量控制标准。
本研究对该方中冰片、猪牙皂、红花和丹参依次进行了定性鉴别,结果显示,冰片和猪牙皂的主斑点清晰可见,阴性对照无干扰,定性鉴别方法专属性强。而红花和丹参与样品色谱相应的位置上阴性均有干扰,因此,该方中红花和丹参的TLC鉴别方法不能收入标准。
猪牙皂在本方配伍中为君药,刺囊酸为猪牙皂中主要有效成分[20],因此采用HPLC法建立刺囊酸的含量测定方法,结果显示,刺囊酸能与样品中其他成分分离良好且保留时间合适,阴性对照无干扰,在刺囊酸供试品制备过程中对乙醚萃取次数进行了考察,实验结果表明,乙醚萃取4次刺囊酸基本可提取完全,因此确定萃取次数为4次。本研究过程中对色谱条件进行了耐用性考察,结果表明,与标准条件(321 nm、1 mL·min-1、25 ℃)样品峰相比,流速和柱温对测定结果影响较大,建议严格控制流速;检测波长在319~323 nm范围内对测定结果无较大影响。综上所述,本研究所建立的方法能作为丹红益脑膏的质量控制标准。