桑叶和桑枝不同炮制品中1-脱氧野尻霉素的含量测定

曾媛媛，李 瑶，姜 维，谢艳华，吴建华*，王四旺

(1.陕西中医药大学药学院，咸阳 712000；2.空军军医大学唐都医院，西安 710032；3.空军军医大学药物研究所，西安 710032)

中药源于自然界，经炮制后方可用于临床，这一独特的加工过程对中药药效的发挥是一个质的飞跃，其中关键的技术保障就是中药炮制[1]。因此，中药炮制直接关系中药的临床疗效，是联系中医和中药的关键环节[2]。作为一项传统中药制药技术，中药炮制的机制尚不清楚，炮制工艺的规范尚不完善，因此中药饮片的质量难以保证。随着现代科学技术的发展，中药炮制过程中的科学内涵不断被揭示，为中药饮片的规范化炮制和临床合理应用奠定了良好的基础[3-5]。中药炮制前后药性和功效发生改变的基础是化学成分发生变化，这种变化主要包括化学成分含量和化学结构的改变。由于中药成分复杂，对于中药炮制前后化学成分的研究主要集中在定量研究。

桑树(MorusalbaL.)在历代《本草》中被称为神木，其根皮、果实、枝和叶皆可入药[6-7]。桑枝具有祛风湿、通经络、行水气的功效[8]；桑叶可驱散风热、清肝明目[9-12]。桑叶味甘、苦、寒，归肺、肝经。桑叶蜜炙能增强润肺止咳的作用，故肺燥咳嗽多用蜜炙桑叶。蒸制具有改变药物性能、扩大用药范围的作用。盐炙药物，有引药下行、增强补肾固精、利尿、清热和滋阴降火凉血等作用，本实验创新性地加入盐炙的方法试图改变桑叶的归经。桑枝味微苦，性平，归肝经。本实验对桑枝采用了相同的炮制方法，最终检测桑叶及桑枝不同炮制品中的1-脱氧野尻霉素的含量[13-16]，为进一步明确不同炮制品中1-脱氧野尻霉素的药效物质基础和建立质量控制标准提供参考[3,17-18]。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-30AD型高效液相色谱仪(日本SMIMADZU公司，包括SIL-30AC型自动进样器和CTO-30A型柱温箱)；API 4000质谱仪(美国AB公司，包括Analyst Softwara数据分析采集软件)；BP221S型万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；TDZ5-WS高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2试药 1-脱氧野尻霉素对照品(上海盛中医药化工有限公司，CAS号：19130962)；乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为自制超纯水；盐酸和甲醇均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

供试桑叶和桑枝均来源于陕西省安康市石泉县，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶和干燥嫩枝，经检验，符合《中国药典》2015年版该品种项下的规定。桑叶和桑枝炮制品由陕西中医药大学药学院炮制实验室加工炮制。

蜜炙：取炼蜜，加适量沸水稀释，淋入净制药材中拌匀，稍闷，置于热锅内，文火(100～120 ℃)炒至不黏手时取出，晾干(每100 kg药材，用炼蜜25 kg)，粉碎，过60目筛。

盐炙：取食用盐，加4倍量水稀释，淋入净制药材中拌匀，润至盐水被药材吸尽后，置于锅内用文火炒至发黄，取出，晾干，粉碎，过60目筛。

蒸制：取净药材，置于笼屉内，下垫清洁细麻布，蒸1 h，取出，晒干，粉碎，过60目筛。

2 方法与结果

2.1UPLC-MS/MS测定条件

2.1.1色谱条件 Agilent HILIC plus色谱柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相：乙腈-0.5 mL·L-1甲酸氨水溶液(10∶90)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：室温；进样量：5 μL。

2.1.2质谱条件 电喷雾离子化(ESI)；检测方法：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5 500 V；加热温度：550 ℃；载气：氮气；流速：120 L·min-1。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液 生品：取原药材，除去杂质，搓碎，去柄，粉碎，过60目筛。

2.2.2对照品溶液 准确称取10 mg 1-脱氧野尻霉素对照品，溶于10 mL 100 mL·L-1的乙腈水溶液，配成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品储备液。将上述对照品储备液稀释，分别配成质量浓度为50，100，200，400，800，1 600和3 200 ng·mL-1的对照品溶液，用0.22 μm针头过滤器过滤，取5 μL，进样。

2.2.3供试品溶液 精密称取不同炮制品粉末0.1 g，置于10 mL离心管中，加100 mL·L-1乙腈水溶液5 mL漩涡混合2 min，超声处理30 min，过滤，以12 000 r·min-1离心30 min，取上清液，残渣再按照上述步骤重复提取1次，合并2次上清液，用100 mL·L-1的乙腈水溶液定容至100 mL，用0.22 μm针头过滤器过滤，取5 μL，进样。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性实验 分别将对照品、样品按照2.1项下条件进样分析，得到UPLC-MS/MS色谱图，见图1。结果表明，物质分离度良好。

图1UPLC-MS/MS图

A.对照品；B.桑叶(原药材)；C.桑叶(生品)；D.桑叶(盐炙)；E.桑叶(蒸制)；F.桑叶(蜜炙)；G.桑枝(原药材)；H.桑枝(盐炙)；I.桑枝(蒸制)；J.桑枝(蜜炙)。

Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

A.reference substance；B.mulberry leaf (natural medicinal materials)；C.mulberry leaf (the crude)；D.mulberry leaf (fried with salt)；E.mulberry leaf (steamed)；F.mulberry leaf (fried with honey)；G.mulberry twig (natural medicinal materials)；H.mulberry twig (fried with salt)；I.mulberry twig (steamed)；J.mulberry twig (fried with honey).

2.3.2线性关系考察 取2.2.2项下制备的系列对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以1-脱氧野尻霉素对照品的质量浓度(x)和色谱峰面积(y)绘制标准曲线，进行线性拟合，得到了1-脱氧野尻霉素质量浓度与色谱峰面积之间的线性回归方程y=62.9x+1.62×104，r=0.992 6，结果表明，1-脱氧野尻霉素质量浓度在50～3 200 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.3.3稳定性实验 将同一供试品溶液在0，2，4，8，16和24 h连续测定6次，按照2.1.1项下色谱条件分别测定峰面积，峰面积RSD值为0.98%。结果表明，1-脱氧野尻霉素在乙腈-水(1∶9)溶液中24 h内稳定。

2.3.4精密度实验 将同一供试品溶液连续进样5次，RSD值为1.49%，结果表明，仪器精密度良好。

2.3.5重复性实验 将同一批样品平行称取5份，按照2.2.2项下方法处理并测定，测得1-脱氧野尻霉素的质量浓度为63.62 μg·mg-1，RSD值为0.94%，结果表明，重复性良好。

2.3.6加样回收率实验 称取已知含量(5.39%)的桑叶粉末58 mg，精密称定，分别加入1-脱氧野尻霉素对照品，按照2.2.2项下方法制备，按照上述含量测定方法进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.3.7最低检测限 在所选条件下，以信噪比等于3计，测得1-脱氧野尻霉素的最低检测限为50 ng·mL-1。

2.4样品测定 依法对桑叶不同炮制品中1-脱氧野尻霉素含量进行测定，桑叶(原药材)、桑叶(生品)、桑叶(盐炙)、桑叶(蒸制)、桑叶(蜜炙)、桑枝(原药材)、桑枝(盐炙)、桑枝(蒸制)和桑枝(蜜炙)中1-脱氧野尻霉素的含量分别为5.34%，5.39%，2.68%，4.41%，2.95%，13.65%，9.44%，12.46%和10.04%。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 The results of sample recovery test (n=3)

3 讨论

3.1提取溶剂的选择 用不同的提取溶剂进行实验，如0.05 mol·L-1HCl、甲醇、稀甲醇、甲醇-水、乙腈-水(3∶7)、乙腈-水(2∶8)等，结果表明，采用乙腈-水(1∶9)溶液作为提取溶剂时，峰面积最大，含量最高。

3.2测定方法的选择 1-脱氧野尻霉素的测定，以前多采用荧光检测器，但样品需要先进行衍生化反应后才可进行检测，具有操作程序繁琐、衍生化反应不稳定等弊端。本文所选的UPLC-MS/MS法，既解决了以上问题，又具有高灵敏度，方便了实验室和检测机构的操作，具有较好的应用前景。

3.3色谱条件的优化 分别比较了Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent HILIC plus(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)柱，发现采用前者色谱柱分离1-脱氧野尻霉素时，分离度较差，峰形呈圆头或平头，无法达到定量要求，改变流动相也无法达到想要的结果，采用后者后，可明显看到分离度提升，峰形改善且分析时间缩短。考察流动相时，发现用甲醇溶解时峰形有拖尾，对流动相进行优选后，乙腈比例过高时峰形不理想，加大水相可逐渐改善，以乙腈-0.5 mL·L-1甲酸氨水溶液(10∶90)时峰形最好。

3.4检测结果 由对桑叶和桑枝不同炮制品的1-脱氧野尻霉素含量测定结果可知，桑叶和桑枝炮制后其1-脱氧野尻霉素含量均降低，桑叶生品的含量大于桑叶原药材中的含量，可能是因为桑叶生品是原药材净制后拣枝梗的原因。经调查，目前中医多采用生品入药。由此可见，桑叶多生用具有一定的科学依据。而本实验桑枝粉末中1-脱氧野尻霉素的含量普遍高于桑叶粉末中的含量，主要原因是在样品的处理过程中1 g桑枝粉末来源于4.1 g桑枝原药材，1 g桑叶粉末来源于1.5 g桑叶原药材，因而同等质量的桑叶原药材和桑枝原药材，桑叶中的1-脱氧野尻霉素含量高于桑枝中的1-脱氧野尻霉素含量，这为桑叶中1-脱氧野尻霉素的利用提供了理论依据。