上皮性卵巢癌中V-ATPase与Ki-67的表达及其临床意义

李泽莲，杨媛媛，韦雯雯，何 静，颜士杰，肖 兰

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)病死率高居女性生殖系统肿瘤首位，确诊时多处于晚期，相对其他妇科肿瘤，恶性程度高，III期EOC患者其5年生存率为23%～41%，对于IV期癌症患者仅为11%[1]。卵巢癌化疗耐药是制约其临床疗效、导致其远期生存率低的关键[2]。肿瘤微环境变化与肿瘤侵袭、进展和耐药密切相关，而肿瘤组织中液泡膜-ATP酶(vacuolar membrane-ATPase,V-ATPase)表达过量或活性增高是形成肿瘤酸性微环境重要原因之一[3]。Ki-67是与增殖细胞相关的核抗原，有研究[4]显示淋巴结转移患者卵巢癌组织中Ki-67表达水平明显高于未发生淋巴结转移的患者，且阳性率高，Ki-67表达越高，患者体内的肿瘤细胞增殖速率越快，更易侵袭而发生淋巴结转移。目前V-ATPase在EOC中表达的临床意义以及与Ki-67表达相关性尚未见报道。该研究通过免疫组化方法分析V-ATPase和Ki-67在EOC中表达及其与临床病理特征的关系，旨在探讨两者在卵巢上皮性肿瘤中的表达和意义。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2015年1月～2016年12月在安徽医科大学第一附属医院进行手术切除的75例EOC患者的病理标本(术前均未行放化疗或生物治疗)。经病理科确诊后收集其完整的临床病理资料。实验组：年龄(54.15±8.03)岁，卵巢肿瘤按照FIGO的分期标准分为：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期60例。卵巢肿瘤按照WHO组织学分级标准分为：浆液性腺癌32例，黏液性腺癌38例，其他类型5例。并同期收取非卵巢疾病患者手术切除的正常卵巢组织40例，年龄(52.09±7.32)岁。标本的收集均获得患者的知情并签订知情同意书。有完整的随访资料。

1.2方法将患者的临床病理资料，如年龄、病理类型、临床分期、肿瘤分级、淋巴转移、脉管浸润、肿瘤大小与V-ATPase表达进行比较。并选用Ki-67作为肿瘤细胞标志物，采用免疫组织化学进行检测。石蜡块标本连续切片，切片厚4 μm，切片进行抗原修复，经过脱蜡、脱二甲苯、3% H2O2封闭和枸橼酸修复液微波修复后，一抗V-ATPase-D1(1 ∶500) 、Ki-67(1 ∶600)(美国Santa Cruz公司)孵育4 ℃过夜，次日复温后，抗兔二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，显微镜下加DAB(5%)显色。经苏木精复染、乙醇化、脱水和中性树胶封片，并在室温风干后光镜下观察。以在细胞质、细胞膜中出现棕褐色细颗粒状为阳性。免疫组织化学结果依据细胞质或细胞膜中出现棕黄色颗粒为V-ATPase蛋白表达阳性细胞，对于每例均随机观察10个高倍视野(×200)，镜下未观察到阳性细胞为阴性(-)，镜下阳性细胞数<5%为弱阳性(1+)，镜下阳性细胞数5%～25%为阳性(2+)，镜阳性细胞数>25%为强阳性(3+)。

1.3统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析。计数资料采用率(%)表示，采用χ2检验或者Fisher′s确切概率法进行比较，V-ATPase与Ki-67关系应用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1EOC组织过表达V-ATPase如图1所示，EOC组织的胞膜及胞质中均有V-ATPase阳性染色，见棕黄色染色，且着色明显。但在正常卵巢上皮组织中，V-ATPase蛋白阳性着色淡，主要位于细胞质中，细胞膜不表达。EOC组织阳性表达率与正常卵巢上皮组织V-ATPase蛋白阳性表达率相比(61.3%vs12.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。相应标记肿瘤细胞标记抗原Ki-67表达与V-ATPase表达呈一致性(图2)。

图1 V-ATPase表达 ×200

A：V-ATPase在正常卵巢上皮细胞中的表达为(-)；B～D：V-ATPase在EOC中的表达程度分别为弱阳性(1+)、阳性(2+)、强阳性(3+)

2.2V-ATPase表达与EOC临床病理的关系V-ATPase表达与EOC患者的年龄、病理类型、脉管浸润无明显相关性(P>0.05)，而与EOC FIGO分期(P=0.002)、病理分级(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.020)以及肿瘤大小(P=0.015)有明显相关性(P<0.05)，见表2。

2.3EOC中V-ATPase和Ki-67的相关性分析经Spearman等级相关分析显示，V-ATPase与Ki-67蛋白在EOC中呈正相关性(rs=0.238，P<0.05)，见表3。

表1 正常卵巢上皮及EOC组织中V-ATPase及Ki-67阳性表达率比较(n)

图2 Ki-67表达 ×200

A：Ki-67在正常卵巢上皮细胞中的表达为(-)；B～D：Ki-67在EOC中分别为弱阳性(1+)、阳性(2+)、强阳性(3+)

表2 V-ATPase的表达与EOC临床病理参数的关系

表3 EOC组织 V-ATPase与Ki-67蛋白的关系(n)

3 讨论

目前，卵巢癌仍是威胁女性生殖健康的主要恶性疾病，其发病率有逐年上升趋势，虽然卵巢癌临床治疗技术已显著提高，但由于不能早期诊断及术后化疗耐药，总的5年生存率仍无明显改善。因此，从分子水平上研究卵巢癌发生、发展机制，寻找合理有效的治疗靶点，是提高卵巢癌生存率、延长生存期、改善生活质量的关键。

V-ATPase位于肿瘤细胞小泡的膜，如溶酶体膜、高尔基体的囊泡膜以及植物液泡膜上，主要参与调节细胞内外的pH值，将肿瘤细胞糖酵解产生的大量H+泵出细胞外，维持肿瘤细胞的生存及其酸性微环境。研究[5-6]表明肿瘤微环境影响微血管形成、肿瘤的生长、侵袭和转移，影响肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性，尤其是酸性微环境与肿瘤增殖、转移和化疗耐药都有关。

本研究中75例EOC组织中V-ATPase阳性表达率为61.3%，在肿瘤细胞膜及细胞质中均表达，同期正常卵巢上皮组织中阳性表达仅为12.5%，故推测V-ATPase高表达与EOC发生有关。分析V-ATPase表达与EOC临床病理特征的关系，显示V-ATPase表达与EOC患者年龄、病理类型无明显相关，而与肿瘤FIGO分期相关(V-ATPase阳性表达率Ⅰ～Ⅱ期为26.7%vsⅢ～Ⅳ期为70%)，提示EOC分期越晚，V-ATPase阳性表达率越高，V-ATPase过表达亦与EOC的发展呈正相关性。本研究中V-ATPase表达与EOC的淋巴结转移、肿瘤组织的分化程度以及肿瘤大小均显示显著相关，提示EOC V-ATPase 高表达的肿瘤增殖较快，较容易发生淋巴结转移。有动物研究[6]提示，在无胸腺的小鼠腹腔里种植卵巢癌细胞，紫杉醇加奥美拉唑联合治疗相比单用紫杉醇，肿瘤体积明显降低；另有研究[7]表明抑制V-ATPase 可诱导Bnip3依赖的肿瘤细胞死亡，从而降低肿瘤负荷和转移。本研究及以上结论均表明V-ATPase高表达与瘤体体积相关。卵巢肿瘤病灶体积<5 cm直径时CA125不易被检测到，因而推论V-ATPase比CA125具有更强的灵敏性和特异性。最近的研究[8-10]提示V-ATPase在乳腺癌及胃肠道恶性肿瘤的生长、转移及侵袭起着重要作用。Ki-67是一种与细胞增殖相关的核抗原，是反映恶性肿瘤细胞增殖活性的重要分子标志物，几乎表达于所有增殖细胞, 与肿瘤增殖、浸润转移及预后关系密切。本研究显示，V-ATPase过表达病例中Ki-67指数亦呈增高趋势，V-ATPase和Ki-67抗原表达呈明显正相关性，即V-ATPase表达水平越高，肿瘤细胞增殖越活跃。V-ATPase导致肿瘤酸性微环境形成，该环境促进EOC细胞异常增殖和恶性转化。故认为Ki-67可能是V-ATPase调控肿瘤酸性微环境形成, 肿瘤细胞过度增殖标志之一。

V-ATPase异常表达使得肿瘤酸性微环境得以产生及维持，目前以V-ATPase为靶点，纠正肿瘤酸性微环境已成为克服肿瘤耐药的一种极具潜力的治疗手段。Ki-67是一种判断细胞增殖状态的指标，将两者结合起来，对于判断EOC的预后和肿瘤靶向治疗的效果极有意义。