氯离子通道蛋白1的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白相互作用的研究

洪翠丽，金振辉，朱亮亮，潘林鑫，耿慧武，刘晓颖

氯离子通道蛋白1(chloride intracellular channel 1,CLIC1)是氯离子通道家族中的一员。CLIC家族中对CLIC1的研究较多，其可以插入膜并形成氯离子通道。CLIC1的膜结合形式中N末端是细胞膜结合位点，C末端在膜内侧[1-2]。CLIC1的C末端与谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase, GST)具有很高的同源性[3-4]；N末端是高度保守区域，含有硫氧还原蛋白区域，可折叠成谷氧还原蛋白，其中CLIC1中的Trp35(色氨酸残基)被认为是CLIC1蛋白的跨膜结合位点[5-6]。以往的研究[7-8]表明CLIC1与神经性疾病、恶性肿瘤增殖相关。 据报道CLIC1的第49～51位3个氨基酸是跨膜结构域中最重要的序列[9]。在本课题组前期已经证实了CLIC1与Sedlin(是SEDL基因的表达产物)在哺乳动物细胞内存在相互作用[10]的基础上，构建第49～51位氨基酸的缺失突变体重组质粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG，进一步研究CLIC1(Δ49-51)与Sedlin在HEK 293T细胞中是否存在相互作用，探究这3个氨基酸的缺失对其与Sedlin相互作用的影响，为进一步揭示CLIC1在肿瘤中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞、质粒和菌株 载体pcDNA3.1、pGEX-5X-3，菌株TG1、BL21、DH5α等，重组质粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG均为本实验室保存。COS7细胞、HEK 293T细胞等也为本实验室常用细胞。

1.1.2主要试剂 PrimeSTAR 酶购自日本TaKaRa公司；BamH I、Xho I、EcoR I等限制性内切酶；质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司；蛋白Marker购自美国Thermo公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；LipofectamineTM2 000、Opti-MEM购自美国Invitrogen公司；FLAG抗体购自美国Sigma公司；荧光封片胶购自丹麦DAKO公司；PVDF膜购自加拿大BioBasic公司；SuperSignal West Pico 显色试剂盒购自美国Pierce公司；激光共聚焦显微镜由安徽医科大学大型仪器共享平台提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养和质粒转染 用DMEM高糖培养基(其中含5%的胎牛血清和100 U/ml的青霉素和链霉素)培养COS7细胞和HEK 293T细胞，其中培养箱为37 ℃、5% CO2；当细胞长满单层时传代，PBS洗2次，胰酶消化至细胞变圆时，DMEM终止消化；离心后用PBS缓冲液重悬细胞清洗，并以适当密度接种到培养皿中，过夜培养；次日，将质粒(μg) ∶脂质体(μl)按1 ∶2.5的比例转染HEK 293T细胞，用于Western blot实验。而免疫荧光实验按1 ∶1.5[质粒(μg) ∶脂质体(μl)]的比例转染，转染4～6 h换新鲜的培养液(不含双抗)。

1.2.2免疫荧光爬片 转染24 h后取出培养皿，用放置在4 ℃冰箱的PBS缓冲液洗3次；-20 ℃预冷的甲醇固定2 min，70%的乙醇固定5 min；1%脱脂奶粉(用TBST配制)封闭30 min；先用FLAG抗体孵育2 h，随后山羊抗小鼠IgG(TRITC标记的)孵育1 h；DAPI染核3 min后，PBS洗3次，每次5 min；荧光封片胶DAKO封片；次日观察并拍摄激光共聚焦照片。

1.2.3GST pulldown实验 同上述转染方法，转染48 h后收细胞，弃去培养液，用PBS小心洗1次，弃去PBS，然后在培养皿中加入适量胰酶，胰酶消化1 min左右(显微镜下观察到细胞从壁上脱落下来)，低速离心(1 500 r/min 、2 min)收集细胞于1.5 ml EP管中，加入适量细胞裂解液(按细胞量的多少具体情况而定)，4 ℃ 层析柜混旋仪上混悬40 min(收细胞的前1 d下午用预温的PBS清洗GST珠子3次，分别加入GST和GST-Sedlin融合蛋白混旋仪上过夜混悬)，把裂解好的细胞裂解液取出40 μl加入10 μl的5×SDS混合，煮沸，冰浴，放于-20 ℃ 冰箱待电泳。把剩下的细胞裂解液分别加入到上述过夜混悬好的GST和GST-Sedlin融合蛋白(过夜混悬好结合缓冲液洗3次)里，再次混悬4 h。混悬结束后(结合缓冲液再次洗3次)加入等量的2×SDS，煮沸7 min,冰上5 min，下一步Western blot分析。

1.2.4免疫共沉淀实验 同上述转染方法，转染48 h后收细胞，弃去培养液，用PBS小心洗1次，弃去PBS，然后在培养皿中加入适量胰酶，胰酶消化1 min左右(显微镜下观察到细胞从壁上脱落下来)，低速离心(1 500 r/min、2 min)收集细胞于1.5 ml EP管中，加入适量细胞裂解液(按细胞量的多少具体情况而定)，4 ℃ 层析柜混旋仪上混悬40 min，把裂解好的细胞裂解液分别取出40 μl加入10 μl的5×SDS混合，煮沸，冰浴，放于-20 ℃冰箱待电泳。把剩下的细胞裂解液分别加入适量的FLAG抗体再次混悬4 h，混悬结束后把混悬好的混合液加入到事先清洗好的琼脂糖珠子里(混悬快结束时用预温的PBS清洗琼脂糖珠子3次)，再次混悬4 h，混悬结束后用IP清洗液再次洗结合珠子3次(4 ℃、3 000 r/min,3 min)弃上清液，加入等量的2×SDS，煮沸7 min,冰上5 min，下一步Westen blot分析。

1.2.5Westen blot分析 配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳先30 min 70 V后80 min 100 V。三明治装置湿转100 V、75 min。取出PVDF膜，封闭液(TBST+5%脱脂奶粉配制)封闭2 h，FLAG鼠抗(1 ∶500)4 ℃孵育过夜，FLAG二抗(1 ∶5 000)孵育1.5 h，显影。

1.2.6核质分离实验 转染48 h后收细胞，胰酶消化2 min，将细胞收集到离心管中并加入5倍体积的CE buffer，同时冰上裂解6 min,间歇震荡裂解液。4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，收集上清液。加入相等量的2×SDS上样缓冲液于上清液中，沸水浴7 min，冰上冷却后，-20 ℃存放备用。用适量的CE buffer(不含NP-40)洗涤沉淀，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，用同样的方法洗涤2～3次以确保除尽沉淀中的胞质蛋白。加入与之相等体积的NE buffer于剩余的沉淀中，冰上裂解11 min，间歇震荡裂解液。4 ℃、14 000 r/min 离心6 min，收集上清液，加入适量5×SDS上样缓冲液，沸水浴7 min，冷却后，-20 ℃存放备用。

2 结果

2.1CLIC1缺失突变体的构建对质粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG进行双酶切(BamH I, Xho I),见图1。CLIC1缺失突变体被切成2条强带，与Marker对比，一条带大约在5 148 bp位置上，另一条位置不超过831 bp，相应的质粒送往通用生物有限公司进行测序，反馈的结果指示质粒构建成功。

图1 重组质粒酶切鉴定图和测序图

M:DNA Marker；1:pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的酶切鉴定结果；2:pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的酶切鉴定结果和测序图

2.2CLIC1及其缺失突变体CLIC1(Δ49-51)蛋白在HEK293T细胞中的表达Western blot结果显示，转染了表达质粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的HEK 293T细胞裂解液分别能检测到相应的条带。与预染蛋白Marker相比较其符合CLIC1蛋白和CLIC1(Δ49-51)蛋白的大小。CLIC1蛋白大小为27 ku，CLIC1(Δ49-51)蛋白的分子量略低于27 ku。见图2。

图2 Western blot检测 CLIC1(Δ49-51)和CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中的表达

1：转染pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的细胞裂解液；2：转染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的细胞裂解液

2.3CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7细胞中的定位以及其与Sedlin蛋白的共定位CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7细胞的细胞核和细胞质中均有明显的表达，且在细胞质表达量明显多于细胞核，见图3A。图3B示CLIC1和Sedlin的共定位。CLIC1(Δ49-51)蛋白与Sedlin蛋白在COS7细胞的细胞核、细胞质中均不存在共定位现象，见图3C。

2.4CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白在体外不存在相互作用分别对CLIC1、CLIC1(Δ49-51)蛋白与Sedlin蛋白进行了GST pulldown实验，即对照组[GST+CLIC1-FLAG/GST+CLIC1(Δ49-51)-FLAG]和实验组[GST-Sedlin+CLIC1-FLAG/GST-Sedlin+CLIC1(Δ49-51)-FLAG]，收集谷胱甘肽珠子进行Western blot分析，见图4A、4B。进行免疫印迹(用FLAG抗体)后，A中1泳道细胞裂解液组和3泳道实验组均出现了明显条带，而B中3泳道实验组和2泳道对照组均未出现任何条带。并且1、3泳道的条带位置基本一致，与预染蛋白Marker 27 ku的条带横向比对后，其大小分别与CLIC1(27 ku)和CLIC1(Δ49-51)(27 ku)的大小相符。同时，又对A、B中的1、2、3的样品进行GST抗体免疫印迹后，见图4A、4B，对照组(2泳道)和实验组(3泳道)分别约在Marker的20～30 ku和30～45 ku之间的位置存在很强的蛋白条带，大小分别与GST(26 ku)和GST-Sedlin(42 ku)融合蛋白的大小相符。综上表明，CLIC1蛋白与Sedlin蛋白在体外存在相互作用，而CLIC1(Δ49-51)蛋白与Sedlin蛋白在体外不存在相互作用。

2.5CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白不存在相互作用在上述GST pulldown体外实验的基础上，进行了相应的免疫共沉淀实验：CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP(对照组)，CLIC1-FLAG+GFP -Sedlin/CLIC1(Δ49-51) -FLAG+GFP-Sedlin(实验组)，见图5A、5B。进行免疫印迹(用FLAG抗体)后，对照组1、2泳道和实验组3、4泳道均出现了明显的条带，与预染Marker比对，目的条带在25～35 ku之间，1～4号泳道条带的大小与CLIC1及CLIC1(Δ49-51)(27 ku)的蛋白大小相符。免疫印迹(用GFP抗体)后，对照组1、2泳道和A中实验组4泳道均出现了明显条带，与预染Marker横向比对，各目的条带的分子量大小正确，而对照组3泳道和B中实验组4泳道未出现任何条带。该结果显示，在HEK 293T细胞中，CLIC1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用，而CLIC1(Δ49-51)蛋白与Sedlin蛋白不存在相互作用。

图3 CLIC1(Δ49-51)在COS7细胞中的定位及其与Sedlin蛋白的共定位

TRITC：FLAG标签蛋白；DAPI：示细胞核；GFP：GFP标签蛋白；MERGE：叠加效果；A：CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7细胞中的定位；B: CLIC1与Sedlin蛋白在COS7细胞中的共定位； C： CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白在COS7细胞中的共定位

图4 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白的GST pulldown实验

1：单转CLIC1-FLAG/CLIC1(Δ49-51)-FLAG的细胞裂解液； 2：谷胱甘肽珠子下拉GST+CLIC1-FLAG/GST+CLIC1(Δ49-51)-FLAG混合液； 3：谷胱甘肽珠子下拉GST-Sedlin+CLIC1/GST-Sedlin+CLIC1(Δ49-51)-FLAG混合液

图5 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白的免疫共沉淀实验

1：共转CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP的细胞裂解液； 2：共转CLIC1-FLAG+Sedlin-GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+Sedlin-GFP的细胞裂解液； 3：用FLAG抗体免疫沉淀共转CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP的细胞裂解液； 4：用FLAG抗体免疫沉淀共转CLIC1-FLAG+GFP-Sedlin/CLIC1(Δ49-51)+Sedlin-GFP的细胞裂解液

2.6CLIC1(Δ49-51)蛋白与CLIC1蛋白在COS7细胞中表达存在差异在上述实验的基础上，进行了CLIC1、CLIC1(Δ49-51)的核质分离实验，见图6，进行免疫印迹(FLAG抗体)后，1～4泳道均出现了明显的条带，与预染Marker比对，目的条带在25～35ku之间，1～4号泳道条带的大小与CLIC1及CLIC1(Δ49-51)(27ku)的蛋白大小相符。以Lamin抗体免疫印迹后，2泳道和4泳道均出现了明显条带，横向比对预染Marker，各目的条带的分子量大小正确。以Tubulin抗体免疫印迹后，1泳道和3泳道均出现了明显条带，横向比对预染Marker，各目的条带的分子量大小正确。该结果显示，在COS7细胞中，CLIC1缺失第49～51位氨基酸后，其在细胞中的定位也发生明显改变，即CLIC1在细胞质和细胞核中均有表达，表达量基本无差别，而CLIC1(Δ49-51)在细胞质和细胞中也均有表达，但细胞质中的表达量明显高于细胞核。

图6 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)的核质分离实验

1：单转CLIC1-FLAG分离的CLIC1细胞质的裂解液；2：单转CLIC1-FLAG分离的CLIC1细胞核的裂解液；3：单转CLIC1(Δ49-51)-FLAG分离的CLIC1(Δ49-51)细胞质的裂解液；4：单转CLIC1(Δ49-51)-FLAG分离的CLIC1(Δ49-51)细胞核的裂解液

3 讨论

CLIC1是真核细胞的重要阴离子通道。研究[9]表明，保守的阳离子基团能增强CLIC1的膜结合能力。把CLIC1跨膜结构域的氨基酸残基第49位的赖氨酸、50位的精氨酸、51位的精氨酸分别用3个连续带负电荷的谷氨酸代替后，即剔除KRR基序能够阻碍膜结合，中断静电相互作用。相反，带正电荷的KRR基序能够形成带正电的阳离子基团即正电元件，CLIC1的跨膜结构域绑定和插入该正电元件，能进一步增强CLIC1的跨膜和插入。被带负电荷的氨基酸替代后，CLIC1蛋白的二级、三级、四级结构发生了改变，减少了整体螺旋度，增加Trp35的极性，进而会影响其功能。

本研究构建了CLIC1第49～51位3个氨基酸的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)，初步探索其对CLIC1蛋白功能的影响。首先把重组质粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG、pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG分别转染至HEK 293T和COS7细胞中，比较CLIC1突变体相对于野生型的表达及定位改变；鉴于本课题组已经证实野生型CLIC1蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用[10]，利用Western blot、免疫荧光、GST pulldown及免疫共沉淀实验，研究缺失突变体CLIC1(Δ49-51)是否与Sedlin蛋白存在体内、体外的相互作用。结果显示，不同于CLIC1与Sedlin蛋白在COS7细胞中存在共定位[11],CLIC1(Δ49-51)与野生型CLIC1在细胞内定位、表达及与Sedlin相互作用方面均存在明显的差异。本研究结果显示，缺失突变体CLIC1(Δ49-51)中带正电荷KRR基序的缺失，使其蛋白结构及活性位点的构象发生改变，以及该位点与周围氨基酸化学键的改变，进而也一定程度上改变了蛋白质的功能(图7)。

图7 CLIC1氨基酸残基(23～57)

CLIC1与肿瘤关系的研究比较多，有相关报道[12-14]表明CLIC1在乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌中的表达明显上调。CLIC1通过参与内质网到高尔基体的蛋白运输进而影响其他调节蛋白的表达[15]，参与肿瘤细胞的增殖、分化以及凋亡过程。因此，研究CLIC1的功能及关键氨基酸位点，为进一步探寻临床肿瘤标志物或治疗靶点提供重要依据。