人骨形成蛋白7对人牙髓细胞增殖和分化的作用研究

喻 刚，蒋玉清，刘文钊，苏玲瑜

人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)的主要成分是牙髓成纤维细胞和少量未分化的间充质细胞，其中，未分化的间充质细胞具有多向分化的潜能，在一定条件下可以向成牙本质细胞分化，这对于牙髓组织的损伤修复意义重大[1-2]。人骨形成蛋白(human bone morphogenetic proteins，BMPs)在牙齿发育和牙髓损伤修复中发挥着重要作用。有研究[3]显示，在动物体内，采用BMP-7(又名成骨蛋白1)与胶原载体复合用于牙齿的直接盖髓治疗，在盖髓部位可见修复性牙本质形成，表明BMP-7是牙髓修复的潜在治疗因子。该研究通过观察BMP-7对人牙髓细胞增殖和分化的影响，探讨BMP-7在人牙髓牙本质复合体损伤修复中的具体作用。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验试剂 BMP-7购自美国Peprotech公司；DMEM低糖培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；胰酶、MTT购自Sigma公司；EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；矿化诱导液购自Biosharp公司；茜素红染液和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；波形丝蛋白(Vimentin)和角蛋白(Keratin)抗体购自英国Abcam公司；FITC标记的荧光二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；cDNA合成试剂盒和qRT-PCR试剂盒均购自美国BIO-RAD公司。

1.1.2实验仪器 Heraeus BB15型细胞培养箱(美国ThermoFisher公司)；BHC-1000IIA/B3型生物安全柜(中国苏净安泰生物技术有限公司)；Sorvall ST16型低速离心机(美国ThermoFisher公司)；IX73型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；Multiscan MK3酶标仪(美国ThermoFisher公司)；ABI7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.2实验方法

1.2.1人牙髓细胞的收集与原代培养 收集临床因正畸或阻生拔除的健康前磨牙(30岁以下，无牙体及牙周疾病)，于无菌条件下用含有双抗的低糖无血清DMEM培养液浸泡并冲洗数遍，劈开牙冠取出牙髓组织，立即用培养基冲洗3遍并充分剪碎，加入2.5 g/L胰酶于37 ℃消化1 h，加入等量含血清培养基终止消化，1 000 r/min离心3 min收集细胞，采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬并接种细胞，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养。每2～3 d换液一次，待细胞融合率达80%后消化并按1 ∶2传代培养。取2～5代的hDPCs进行Vimentin和Keratin免疫荧光检测鉴定，并开展后续实验。

1.2.2EdU细胞增殖检测 收集对数生长期的hDPCs并接种于96孔板中，次日，向孔中加入终浓度为50、100和200 ng/ml 的BMP-7处理细胞，每个浓度3个复孔，并设置溶剂对照组。将EdU加入各处理组共同孵育36 h以标记增殖细胞，按试剂盒操作说明对细胞进行固定染色，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.3MTT法检测细胞活力 收集对数生长期的hDPCs并接种于96孔板中，次日，采用1.2.2项下的方法处理细胞。于处理1、3、7、10 d行MTT检测：向每孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃孵育2～4 h，再加入50 μl 质量浓度为200 g/L的酸性SDS溶液，于37 ℃溶解甲臜过夜，最后采用酶标仪检测570 nm波长下的吸光度值。

1.2.4矿化结节检测 收集2～5代的hDPCs并接种于96孔板中，待细胞贴壁后向孔中加入含50、100、200 ng/ml BMP-7的矿化诱导液(含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 g/L 维生素C的DMEM培养基)处理细胞，每3 d更换一次诱导液。于处理后的第10天吸出诱导液，采用PBS洗3次，甲醇固定15 min，PBS洗2次，加入茜素红染液于37 ℃染色30 min，PBS洗3次，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5碱性磷酸酶活性检测 收集对数生长期的hDPCs并接种于24孔板中，采用1.2.4项下的处理方法诱导细胞。分别于诱导培养后第1、3、7、10天弃去诱导液并裂解细胞，按碱性磷酸酶检测试剂盒操作说明进行相应处理，并检测405 nm波长下的吸光度值。

1.2.6实时荧光定量PCR 收集对数生长期的hDPCs并接种于6孔板中，采用1.2.4项下的处理方法诱导细胞，并于诱导培养后第10天进行牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1，DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)mRNA表达水平的测定：按试剂盒操作说明提取hDPCs总RNA，逆转录成cDNA，再进行荧光定量PCR检测。使用的引物序列如下：DMP-1(forward)：5′-GTGAGTGAGTCCAGGGGAGATAA-3′，DMP-1(reverse)：5′-TTTTGAGTGGGAGAGTGTGTGC-3′；DSPP(forward)：5′-CTGTTGGGAAGAGCCAAGATAAG-3′，DSPP(reve-rse)：5′-CCAAGATCATTCCATGTTGTCCT-3′；GAPDH(forward)：5′-CAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′，GAPDH(reverse)：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCA-3′。以GAPDH mRNA表达水平作为内参，通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化进行定量分析。

2 结果

2.1hDPCs细胞来源鉴定细胞免疫荧光的检测结果显示，原代培养的hDPCs细胞Vimentin检测结果为阳性，胞质内可见明显的绿色荧光，而Keratin检测呈阴性(图1)。该结果表明原代培养的hDPCs来源于中胚层的间充质细胞。

2.2BMP-7对hDPCs增殖的影响如图2A和2B所示，采用不同浓度的BMP-7(50、100和200 ng/ml)处理hDPCs后，对照组和BMP-7处理组hDPCs中红色标记的增殖细胞数量差异无统计学意义；此外，MTT细胞活力检测结果也显示，采用BMP-处理细胞1、3、7、10 d后，各时间点的BMP-7处理组与对照组相比，hDPCs细胞生长活力差异无统计学意义(P>0.05)，不同浓度BMP-7处理组之间细胞活力也无明显差异(图2C)。结果表明，BMP-7对hDPCs增殖无明显影响。

图1 细胞免疫荧光鉴定hDPCs 细胞免疫荧光×200

图2 不同浓度BMP-7对hDPCs增殖的影响 EdU染色×100

图3 不同浓度BMP-7诱导hDPCs矿化结节形成情况 茜素红染色×100

2.3BMP-7对hDPCs钙化结节形成的影响采用含不同浓度BMP-7的矿化诱导液(BMP-7浓度分别为50、100和200 ng/ml)处理hDPCs 10 d后，BMP-7处理组茜素红染色均呈阳性，可见明显的矿化结节，且矿化结节的量随BMP-7浓度的升高而增多(图3)。

2.4BMP-7对hDPCsALP活性的影响采用含不同浓度BMP-7的矿化诱导液处理hDPCs 3、7、10 d后，BMP-7处理组ALP活性值显著高于对照组(P<0.01)，且在同一时间点内，ALP的活性随着BMP-7浓度的升高而显著增强；随着作用时间的延长，各处理组ALP的活性也有明显提升(表1)。

表1 各时间点不同浓度的BMP-7处理组在405 nm处的吸光度值(n=3)

2.5BMP-7对成牙本质相关基因表达的影响采用不同浓度的BMP-7矿化诱导液处理hDPCs 10 d后，各BMP-7处理组DMP-1和DSPP mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)，且随着BMP-7浓度的升高，两种基因的表达水平也有显著提升(图4)。

图4 BMP-7对成牙本质相关基因表达的影响

3 讨论

BMP-7属于TGF-β细胞因子超家族中骨形成蛋白亚家族，又称为成骨蛋白1，具有多种生物学功能。有研究[4]显示，BMP -7是一种重要的肾脏调节因子，与肾脏疾病的发生、发展、转归密切相关，对维持肾脏的正常结构和功能也有重要意义。此外，BMP-7还具有抑制器官纤维化的作用[5-6]，还可用于诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化[7]。而作为一种重要的成骨诱导因子，其主要功能则在促进骨骼的发育和损伤修复方面，诸多实验和临床研究[8]表明，BMP-7能促进骨折愈合，并已在临床上用于多种骨科疾病的治疗。同时，在牙髓生物学领域，BMP-7在成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成中具有重要的作用，并能诱导牙乳头细胞发生功能性分化[3]。林正梅 等[9]采用重组腺病毒介导hBMP-7基因转染人牙髓细胞，发现与空载体组和未转染细胞组相比，hBMP-7基因转染组检测到了牙髓细胞向成牙本质细胞分化，表明BMP-7在牙髓的损伤修复中也具有重要的调控作用。由此可见，BMP-7在保髓治疗中也具有很大的应用前景。

本研究直接采用BMP-7因子处理人牙髓细胞，并运用多种评价指标检测BMP-7在诱导牙髓细胞增殖及分化中的作用。其中，ALP是评价牙髓细胞早期分化的重要标志物。当牙髓中的未分化间充质干细胞向成牙本质细胞分化时，ALP活性显著提升。DMP-1在牙本质形成和矿化过程中具有重要作用，它的表达水平可以提示牙髓细胞向成牙本质细胞分化的程度。DSPP是牙本质非胶原蛋白的主要成分，可以作为成牙本质细胞的特异性标记蛋白。结果显示，经BMP-7处理的hDPCs，细胞增殖无显著变化，但可形成明显的矿化结节，且ALP活性呈剂量和时间依赖性地增加，DMP-1和DSPP的表达水平也较对照组显著提升，进一步证实了BMP-7可以诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化。

BMPs家族蛋白发挥生物学效应的分子机制涉及两条重要的信号通路：Smads介导的信号通路和MAPK途径。前者是由靶细胞膜上BMPs受体及细胞质内各型Smads蛋白协同参与完成，是TGF-β超家族包括BMPs信号转导的经典通路；后者属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要在Smads途径被阻断后，作为补救途径来介导BMPs信号的传递[10]。大量研究显示，BMPs诱导的牙髓细胞分化与两种信号通路均有关联。Qin et al[11]的研究显示，在诱导向成牙本质细胞分化的过程中，BMP-2的加入促进了Smad1/5磷酸化，而采用BMP信号抑制剂Noggin选择性抑制Smad蛋白活性，则可显著抑制牙髓细胞的分化，表明Smad1/5在其中发挥了重要的调控作用。Yang et al[12]的研究则发现，BMP-2通过刺激p38 MAPK信号通路，激活了调控干细胞生长的WNT/ β-catenin信号，这一信号级联也是调控牙髓细胞分化的主要分子机制。此外， Li et al[13]的研究也表明MAPK通路参与了BMP-9诱导牙囊干细胞分化的调控。由此我们推断，BMP-7诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化也可能受到了Smads信号通路和MAPK途径的调控。

综上所述，BMP-7可诱导hDPCs向成牙本质细胞分化，而对hDPCs增殖无显著影响，其诱导牙髓细胞分化的作用机制可能与BMPs/Smads和MAPK信号通路的调控相关，具体机制有待进一步探讨。