BMP4对神经干细胞分化的影响及分子机制的研究

夏 翔，宋旆文，牛 杨，杨 超，申才良

严重的脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)会造成不同形式的瘫痪，目前来说仍然无十分有效的治疗，这带来了巨大的个人和社会经济损失[1]。近年来随着干细胞研究的兴起，为治疗SCI以及类似神经系统疾病带来了新希望。但是研究[2]显示，损伤后无论是内源性的神经干细胞增生，还是移植的外源性神经干细胞，均不能有效的分化为神经元或者少突胶质细胞等神经功能细胞，而是较多的分化为星形胶质细胞。然而星形胶质细胞在损伤局部主要形成胶质瘢痕，阻碍了轴突的再生，抑制了神经功能的恢复[3]。研究[4-6]显示骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)(BMP2/4/7)蛋白在损伤局部高表达，同时高表达的BMP会促进星形胶质细胞的分化，抑制神经元的分化。本实验通过体外培养神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，添加外源性BMP4蛋白以及其受体拮抗剂Noggin蛋白，观察其对NSCs分化的影响以及探索其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料DMEM/F12 细胞培养液和胎牛血清 (FBS) 以及B-27细胞因子(美国Gibco公司)；细胞表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 和碱性细胞成纤维生长因子(basic fbroblast growth factor,bFGF)(美国PeproTech公司)；兔抗小鼠胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体、兔抗小鼠-Id2抗体(美国Abcam公司)；pSamd1/5/8抗体 (美国Cell Signaling公司)；包被用左旋氏多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)(美国Sigma公司)；ECL蛋白显影液试剂盒、BCA 蛋白定量检测试剂盒(美国Pierce公司)；Transwell培养板(美国Corning公司)；Dapi、免疫荧光一抗稀释液、免疫荧光二抗稀释液、青/链霉素溶液、即用型胰蛋白酶细胞消化液、抗荧光淬灭封片液(上海碧云天公司)；BMP-4蛋白(美国Peprotech公司)。18 mm细胞爬片(江苏世泰公司),超净工作台(香港力康公司HFsafe-1200LC Healforce),细胞培养箱(美国希尔顿公司),手术解剖显微镜(奥林巴斯SZ51，日本),荧光显微镜(尼康80i，日本)。SPF级SD新生乳鼠购自安徽省实验动物中心。

1.2NSCs的培养取1只24 h内新生SD乳鼠，用70%酒精消毒后断头，依次剪开皮肤、颅骨，迅速取出脑组织置于冰上含有预冷PBS液的培养皿中。弃去小脑部分，在解剖显微镜的帮助下，彻底去除每个皮层的脑膜以及血管，将清理好的脑组织用眼科剪剪成约1 mm3小碎块，加入1.5 ml胰酶，将组织和胰酶混悬液置于细胞培养箱中消化7 min，用2 ml含有10% FBS的DMEM/F12终止消化，用微量移液枪轻轻吹打使细胞尽可能分散，200目滤网滤过去除未消化组织，将细胞悬液移入15 ml离心管，然后1 000 r/min离心5 min，再次加入适量PBS吹打悬浮细胞，然后1 000 r/min离心5 min，尽量去除上清液，将其沉淀重新悬浮于5 ml的NSC增殖培养基中(DMEM/F12培养基，加入2% B27补充剂、20 ng/ml EGF和20 ng/ml FGF以及1%青/链霉素溶液)。将细胞以1×105/ml的密度接种于T25细胞培养瓶中。然后将细胞放在37 ℃、5% CO2温箱中培养，每3 d更换1次培养液，直至第7天，当NSCs增殖形成悬浮球，进行传代。

1.3NSCs体外分化实验将预先灭菌的细胞爬片置于6孔细胞培养板中，用1%多聚赖氨酸包被60 min，吸去多余的多聚赖氨酸，蒸馏水洗2遍每次5 min，将包被好的细胞爬片，连同6孔细胞培养板放在37 ℃细胞培养箱中晾干，选取生长状况良好的2代或者3代细胞进行下一步的实验，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用不含EDTA的胰酶将细胞消化1 min，用2 ml含10% FBS的DMEM/F12终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，吹散细胞，将细胞用增殖培养液培养24 h，待细胞完全贴壁，吸去培养液，重新加入分化培养基中培养，分为3组：BMP4组(分化培养基为DMEM/F12基础培养液，添加20 ng/ml BMP4蛋白以及1%青/链霉素溶液)、BMP4+Noggin组(分化培养基为DMEM/F12基础培养液，添加20 ng/ml BMP4蛋白以及200 ng/ml Noggin蛋白以及1%青/链霉素溶液)、Control组(分化培养基为DMEM/F12基础培养液以及1%青/链霉素溶液)，待到分化第7天进行下一步实验。

1.4NSCs分化的鉴定取爬片7 d后分化状态良好的细胞，吸出培养基，沿培养板侧壁轻轻加入适量PBS清洗2次,每次5 min(为了防止细胞被吹离爬片以后每步加液均按此步骤进行)，用经预热的4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗3次，每次5 min，用预先配好的0.3% Triton X-100，洗1次、5 min，TBS清洗1次、5 min，PBS清洗2次，每次5 min，5%BSA在37 ℃温箱孵育封闭1 h，尽量吸去多余的BSA，孵育1抗，兔抗鼠GFAP 1 ∶1 000，4 ℃湿盒内孵育过夜，第2天取出在室温下放置40 min，TBS洗1次、5 min，PBS洗3次，每次5 min。加二抗:山羊抗兔IgG-Cy3(1 ∶100)；室温下，避光孵育1 h，以后操作都在避光下进行，TBS洗1次，PBS洗2次,每次5 min，用Dapi染核10 min，PBS洗3次，每次5 min。用吸水纸吸光玻片周围水使玻片干燥，加抗荧光淬灭剂封片，4 ℃避光保存，荧光显微镜(日本尼康80i)拍照。

1.5Westernblot检测将 NSCs接种在经0.1%多聚赖氨酸包被的玻片上，其中BMP组加入20 ng/ml BMP4，BMP4+Noggin组加入20 ng/ml BMP4和200 ng/ml Noggin，Control组加入等量的PBS，贴壁培养7 d。提取各组细胞分化后的总蛋白，用BCA蛋白定量检测试剂盒测定各组蛋白含量，确定电泳上样量为20 μg， 蛋白行10% SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，非特异性封闭。加入一抗pSmad1/5/8、Id2兔多抗，所使用抗体稀释浓度为GAPDH(鼠单抗，1 ∶1 000)、GFAP(兔多抗，1 ∶1 000)、pSmad1/5/8(兔多抗，1 ∶500)、Id2(兔多抗，1 ∶1 000)。4 ℃ 冰箱内孵育过夜，加入对应的二抗; 4 ℃孵育1 h，用ECL发光剂时间为5 min，通过进行曝光、显影、定影一系列操作后使用数码分析成像软件对实验结果进行统计分析，用目的蛋白的灰度值表示相对表达的目的蛋白水平。

1.6细胞计数荧光显微镜用于检查免疫染色的细胞。 为了确定表达GFAP的细胞数量，由未参与该项试验，并且熟悉统计学方法的人员，随机选择每个玻片的20个视野进行细胞计数。 结果表示为GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)数量相对于DAPI阳性细胞总数的百分比。

2 结果

2.1BMP4对NSCs分化的影响用GFAP进行特异性荧光免疫染色，鉴定不同分组星形胶质细胞的分化，红色为GFAP特异性标记星形胶质细胞(图1A)。细胞计数检测GFAP阳性细胞的表达，与Control组(阳性率64.9%±2.04%)相比，BMP4组(阳性率94.6%±1.49%)的GFAP表达显著增加。与BMP4组相比，BMP4+Noggin组(阳性率31.6%±1.21%)中表达GFAP的细胞的阳性率显著降低(F=381.1，P<0.01)(图1B)。同时用Western blot检测GFAP蛋白的表达，发现与Control组相比，BMP4组的蛋白表达明显升高；与BMP4组相比，BMP4+Noggin组的蛋白表达明显减少(F=126.2，P<0.01)，见图2。

2.2BMP4对pSmad1/5/8蛋白表达的影响用蛋白质免疫印迹技术检测分化7 d的Control组、BMP4组和BMP4+Noggin组中pSmad1/5/8蛋白的表达。发现BMP4组中pSmad1/5/8的表达显著高于对照组和BMP+Noggin组(F=2 149，P<0.01)，见图3。

图1不同分化条件下NSCs免疫荧光GFAP阳性表达

A：星形胶质细胞的免疫荧光染色鉴定 ×200；红色：GFAP标记星形胶质细胞；蓝色：Dapi标记细胞核；合成：将细胞与细胞核进行融合；B：NSCs分化为星形胶质细胞的阳性率表达比较；与Control组比较：**P<0.01；与BMP4+Noggin组比较：##P<0.01

图2 NSCs分化后GFAP蛋白表达量的比较

与Control组比较：**P<0.01；与BMP4+Noggin组比较：##P<0.01

图3 NSCs分化后pSmad1/5/8蛋白表达量的比较

与Control组比较：**P<0.01；与BMP4+Noggin组比较：##P<0.01

2.3BMP4对Id2蛋白表达的影响通过Western blot 检测不同分组中Id2蛋白的表达水平。 BMP4组Id2蛋白的表达显著高于Control组和BMP4+Noggin组(F=978.9，P<0.01)，见图4。

图4 NSCs分化后Id2蛋白表达量的比较

与Control组比较：**P<0.01；与BMP4+Noggin组比较：##P<0.01

3 讨论

本实验检测了BMP信号通路中pSmad1/5/8及其下游Id2蛋白的表达，同时用星形胶质特异性抗体、GFAP进行免疫荧光染色，检测星形胶质细胞的表达。证实了BMP4在NSCs分化过程中通过上调Id2的表达，促进了星形胶质细胞的分化。

BMP是信号传导配体转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员。其通过信号转导进入细胞核进行转录调控，BMP在神经发生和星形胶质发生过程中起着动态的作用[4]。BMP4作为BMPs家族中重要的一员，在体内外的实验中被证实可以抑制NSCs向神经功能细胞分化，抑制了神经功能的恢复[3]，研究[6]显示，BMP的应用可以减少NSCs向少突胶质细胞的分化，并促进其向星形胶质细胞的分化。这与本研究结果BMP4增加NSCs分化中星形胶质细胞的表达是一致的。然而BMP是通过何种途径增加星形胶质细胞的分化，其具体机制并不十分清楚，因此探索其可能的分子机制十分必要，这也是本实验重点。

骨形态发生蛋白通过BMP信号通路和信号通路下游受体(Smad1/5/8)发挥生物学作用，其中受体的磷酸化发挥着不可或缺的作用，当BMP信号通路激活，其使下游受体Smad1/5/8磷酸化，同时磷酸化的Smad1/5/8(pSmad1/5/8)可以进入细胞核内调控目的基因的转录。本研究通过免疫荧光染色检测星形胶质的细胞表达，以及Western blot检测GFAP蛋白和pSmad1/5/8蛋白的表达，结果表明BMP4的应用可以促进NSCs分化为星形胶质细胞，同时pSmad1/5/8蛋白表达增加，加入BMP受体拮抗剂Noggin后，随着pSmad1/5/8的表达减少，GFAP表达显著降低。此结果与其他研究的结果一致，因此认为BMP4可以通过BMP-Smad1/5/8信号通路促进了星形胶质细胞的分化[7]，初步探索了其可能的分子机制。

Id家族是细胞命运的重要调节因子，包括增殖、分化和凋亡，Id蛋白的高表达可以抑制神经元的分化，促进星形胶质细胞的分化[8]。Id2是Id家族中最重要的成员之一，在调节细胞增殖和维持细胞多样性和分化方面起着至关重要的作用[9]。 研究[10]表明，在SCI早期，Id蛋白的表达显著增加，这与损伤后BMP表达的增加是相一致的，同时Id蛋白的高表达促进了损伤部位星形胶质细胞的分化。有研究[11]表明BMP2可以上调下游基因Id2的表达，促进少突胶质前体细胞向星形胶质细胞的分化，同时抑制了这些细胞分化为少突胶质细胞。因此推测BMP使体外培养的NSCs星形胶质细胞分化增多，是由Id蛋白表达增加介导的。为了探索Id蛋白在NSCs分化过程中的作用，本研究通过Western blot检测不同组中Id2蛋白的表达。发现随着BMP信号通路的激活，Id2蛋白表达增加。然而使用Noggin抑制BMP信号通路时，Id2的表达显著减少。因此BMP4可以通过BMP-Smad1/5/8信号通路调节Id2基因的表达，这相关研究[12]结果是一致的。本实验证实BMP4能够通过BMP-Smad1/5/8信号通路上调Id2的表达，促进NSCs分化为星形胶质细胞，同时确定了Id基因在NSCs分化中的作用。

综上所述，本实验通过NSCs体外分化证实了BMPs可以激活BMP-Smad1/5/8信号通路上调Id2的表达，从而促进星形胶质细胞的分化，确定了其可能的分子机制。本实验的结果为如何调控SCI后星形胶质细胞的分化进而调控胶质瘢痕大小提供了新的思路。本研究的局限性是没有进行动物实验来进一步证实本实验的结论，这将是下一个研究重点。