IL-17调控PI3K/AKT/FAS/FASL信号通路抑制Hep-2细胞凋亡

杨 明，宋 杨，张红健，季加标，杨见明

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占头颈部肿瘤的三分之一，病理类型以鳞状细胞癌为主[1]。临床上喉癌的治疗主要以手术治疗或者手术联合放化疗为主，患者的喉功能如吞咽、发音功能受到不同程度的影响，并降低患者生活质量，研究新的治疗方案如免疫治疗对此类患者具有很大的前景[2]。白介素-17(interleukin-17，IL-17)是一种由CD4+ T Th17细胞、γδT 细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、TCRβ+ Th17细胞分泌的促炎细胞因子[3]。IL-17在肿瘤免疫中发挥重要作用， 研究[4]表明IL-17通过促进肿瘤血管生成促进肿瘤生长和转移。研究[5]显示IL-17可以抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠MDSCs细胞(髓系来源的抑制细胞)的凋亡。课题组前期研究[6]结果表明IL-17可以通过调控IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3信号通路影响喉癌细胞的侵袭和转移。然而IL-17对喉癌细胞凋亡的影响及其具体机制查阅国内外相关文献尚未见报道，该研究在前期研究基础上，重点研究IL-17对喉癌细胞凋亡的影响及体外机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养上皮样细胞Hep-2细胞，属于人源性高分化喉癌细胞系，呈单层贴壁生长状态，购自南京凯基生物科技发展有限公司。常规细胞培养基(RPMI 1640+10%胎牛血清+100 mg /L青霉素+100 mg/L 链霉素)培养Hep-2细胞，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育，1～2 d传代或者换液一次。

1.2试剂200-17(IL-17刺激剂，对IL-17具有生长刺激作用)购自美国PEPROTECH公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；RPMI1640培养液购自美国HyClone公司；抗PI3K单克隆抗体、抗p-PI3K抗体购自美国Abcam公司；抗Fas抗体、抗FasL抗体、抗AKT抗体、抗p-AKT抗体购自美国CST公司；抗β-actin 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购自美国ABclonal公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；BCA法蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、蛋白 Marker、胰酶、一抗稀释液、二抗稀释液、ECL荧光剂(显影剂)均购自上海碧云天生物有限公司。

1.3仪器NAPCO-8800型恒温细胞培养箱购自美国SHELLAB公司；SW-9800型超净工作台购自苏州泰安空气技术有限公司；Western blot电泳仪(Tanon)购自上海天能科技有限公司；CytoFLEX流式细胞仪购自美国BECKMAN COULTER公司。GraphPad Prism 6图像处理软件；Image-Pro plus 图像处理系统。

图1 流式细胞术检测IL-17对Hep-2细胞凋亡的影响

1.4AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测将Hep-2细胞消化后以相同的量接种到6孔板中(接种6孔，每孔细胞数为1×106)，待细胞贴壁后，弃去培养液，用PBS洗2次，对照组加入RPMI1640，实验组加入含50 ng/ml 200-17的RPMI1640，分别处理6、12、24 h后胰酶消化细胞，收集至15 ml 离心管中，300 g 4 ℃ 离心5 min，弃去上清液， 用400 μl PBS 洗涤2次，Annexin V-FITC/PI 双荧光(FITC 50 mg/L， PI 50 mg/L) 避光染色 10 min，CytoFLEX流式细胞仪检测，CytExpert分析软件分析检测结果。

1.5Westernblot法检测不同浓度200-17刺激Hep-2细胞后PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白表达的变化将对数生长期的Hep-2细胞消化后以相同的量接种6孔板中(接种四孔，每孔细胞数大约为1×106)，待细胞贴壁后，弃去培养液，用PBS洗2次，在4个孔中分别加入含不同浓度200-17(0、1、50、100 ng/ml)的RPMI1640处理6 h，弃去培养液，4 ℃预冷PBS清洗细胞，培养板中加入蛋白裂解液(含PMSF及磷酸化酶抑制剂)充分裂解细胞，13 000 r/min 4 ℃离心20 min,吸取上清液；BCA试剂盒检测蛋白浓度后分装保存。根据测定的蛋白浓度加入相应体积的总蛋白样品和5×loading buffer(比例为4 ∶1)，混匀后在干浴锅中100 ℃煮10 min，蛋白变性后的样本于-20 ℃冰箱中保存。每泳道加20 μg蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；分离凝胶中的蛋白并转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温摇床上封闭2 h。TBST 洗涤4次，每次5 min，分别与抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL、β-actin抗体4 ℃下孵育过夜。TBST洗涤4次，每次5 min，将膜置于相对应二抗内室温摇床下孵育1 h，TBST 洗涤5 min×4次后，ECL化学发光底物显影检测蛋白。用Image-Pro plus图像处理系统分析计算Western blot灰度值。

2 结果

2.1IL-17刺激不同时间后Hep-2细胞的凋亡率通过Annexin V-FITC/PI双染法检测200-17作用6、12、24 h后Hep-2细胞的凋亡率。结果显示，对照组和实验组凋亡率逐渐增高，与对照组相比，加50 ng/ml 200-17作用6、12、24 h后，Hep-2凋亡率均降低，200-17作用6 h后与对照组比较，实验组Hep-2细胞凋亡率降低最明显。6 h对照组凋亡率为(12.56±2.51)%，6 h实验组凋亡率为(2.47±0.96)%，12 h对照组凋亡率为(26.79±1.48)%，12 h实验组凋亡率为(19.79±2.16)%，24 h对照组凋亡率为(32.35±1.3)%，24 h实验组凋亡率为(24.10±1.17)%。采用t检验比较，差异有统计学意义(t=4. 629，P<0. 01)。见图1。

2.2不同浓度200-17刺激Hep-2细胞时PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Fas、FasL蛋白的表达用不同浓度(0、1、50、100 ng/ml)的200-17刺激Hep-2细胞，随着200-17浓度的升高，Hep-2细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表达逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.01)；PI3K、AKT蛋白表达差异无统计学意义。与0 ng/ml组相比，1、50、100 ng/ml组200-17刺激后Hep-2细胞内Fas、FasL蛋白表达降低(t=-3.258、-2.738，P<0.01) 。随着200-17浓度升高，FasL表达逐渐降低；与对照组、1 ng/ml组相比，100 ng/ml组Fas蛋白表达降低，然而与50 ng/ml组相比，Fas表达增高(t=-4.247，P<0.01)。见图2。

图2 不同浓度IL-17刺激下Hep-2细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、FAS、FASL分子表达的变化

1：0 ng/ml 200-17组；2：1 ng/ml 200-17组；3：50 ng/ml 200-17组；4：100 ng/ml 200-17组；与0 ng/ml 200-17组比较：**P<0.01

3 讨论

喉鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的1%～2.5%[7]。目前喉癌的主要治疗方法包括手术、放疗、手术联合放疗/化疗的综合治疗[2]。手术治疗后患者发音功能重建效果不佳，部分患者喉功能完全损失，对患者生存质量造成较大影响，开发新的治疗方案如免疫治疗非常有必要[8]。

IL-17是一种由多种细胞分泌的促炎细胞因子， IL-17与其受体结合后，可以作用于巨噬细胞、T细胞、上皮细胞、内皮细胞等多种细胞，诱导IL-6、IL-1β、TNF-α等多种促炎因子和CXCL-1、 CXCL-8、 CXCL-10、MCP-1等趋化因子从而发挥促炎作用，同时IL-17与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤的发生发展密切相关[9-10]。研究[9]表明IL-17通过激活Src/PI3K/Akt/nuclear factor-κB (NF-κB)、MAPK、 Stat3、COX-2信号通路在调控肿瘤生长、参与肿瘤血管生成及侵袭与转移中发挥重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号通路之一，并有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点[11]。头颈部肿瘤中PI3K信号通路的异常激活能促进肿瘤的异常增殖及肿瘤的发生发展[11-12]。研究[13]显示在星形胶质瘤细胞中IL-17能够激活PI3K/AKT信号通路。本研究用不同浓度IL-17刺激Hep-2细胞后，采用Western blot分析PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达，结果显示，采用不同浓度(0、1、50、100 ng/ml)IL-17处理Hep-2细胞6 h后，随着浓度增加，p-PI3K、p-AKT表达逐渐增加，呈浓度依赖性。提示IL-17能够激活Hep-2细胞中PI3K/AKT信号通路。

Fas和FasL(Fas配体)分别是肿瘤坏死因子(TNF)受体和TNF家族成员，Fas介导的凋亡途径是肿瘤细胞凋亡的主要途径之一，Fas与FasL的结合导致caspase级联反应进而导致细胞凋亡[14]。Fas介导的凋亡途径在免疫监视和维持体内平衡中起关键作用，并且是药物诱导的凋亡的介质[14]。研究[15]显示磷酸化AKT能够活化Forkhead家族成员FOXO转录因子，下调FasL诱导的凋亡过程。Western blot结果显示，与对照组相比，实验组p-AKT表达逐渐增加，Fas、FasL表达降低，此结果支持磷酸化AKT下调FasL的表达从而下调Fas介导的凋亡途径的观点。与对照组、1 ng/ml组比较，100 ng/ml组Fas蛋白表达降低，然而与50 ng/ml组相比，Fas表达增高，考虑可能与Fas的表达在200-17浓度为50、100 ng/ml时进入平台期有关[16]。采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与对照组相比，采用50 ng/ml 200-17处理Hep-2细胞6、12、24 h后，Hep-2细胞凋亡率减少。结合以上，本研究的结果提示，IL-17可以抑制Hep-2细胞凋亡。