不同炮制方法对补骨脂中抗骨质疏松成分含量水平的影响*

张 健，张 伟2

1. 河南省开封市食品药品检验所(开封475000),2.黄河科技学院(郑州450063)

主题词 炮制(中药) 补骨脂 补骨脂素 色谱法, 高压液相 中药化学成分

补骨脂有被称为破故纸，婆固脂，胡韭子等，是一年生豆科直立草本植物，形态特征为单叶互生，叶宽卵形，花序腋生，花冠呈黄色或蓝色，荚果呈卵形[1]。中医以其干燥果实入药，具有补肾壮阳、补脾健胃之功效，药用价值较高[2]。骨质疏松的临床表现为骨骼疼痛、易骨折等，它是由多种原因导致的骨骼疾病，表现为单位体积内骨组织量减少代谢性骨病变，而骨组织减少的原因主要是骨质吸收增多[3-4]，大量临床研究表明，补骨脂提取物中对增加骨组织有良好效果，可有效治疗骨质疏松症[5-8]。中药学研究表明，中药成分在萃取过程中，易受到炮制方法的影响，在提取过程中，有效成分可能会发生转化或分解反应，导致有效成分的流失[9]，本文通过对4种不同方法炮制的补骨脂提取物进行含量分析，为中医炮制补骨脂提供参考，现报告如下。

材料与方法

1 仪 器 液相仪：配备有自动进样器的美国Waters e2695高效液相色谱仪，2998型二极管阵列检测器，均为美国Waters公司产品；天平：十万分之一天平，量程0.01 mg～220 g，为德国Sartorius CP225D；超声波清洗器：郑州生元仪器有限公司SYV-22-600DTD；多功能粉碎机为上海兆申有限公司产品，型号XS-03。

2 试 剂 水为娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈均为色谱纯(北京迪玛欧泰科技发展中心产品)；补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚对照品均为中检所对照品，扣除水分后纯度均在95.0%以上；补骨脂药材产自云南，经外形对比和提取物鉴定为豆科植物补骨脂果实。炮制用酒为为黄酒(10.0±1.0)%，绍兴吴越酿酒有限公司产品；炮制用盐为中盐，为中国盐业总公司产品。

3 方 法

3.1对照品储备液配制:用十万分之一天平分别称量补骨脂素对照品34.61 mg、异补骨脂素对照品33.63 mg、补骨脂定对照品35.13 mg、补骨脂酚对照品35.86 mg分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇5 ml，冰域超声30 min，待其冷却至室温后，使用甲醇定容摇匀得对照品储备液。

3.2 供试品配制

3.2.1 不同炮制方法:按照下述不同的炮制方法，每法平行制作3份样品。盐灸法(药典法)：称取干燥补骨脂果实100 g，经0.1 g/ml盐水浸泡4 h后，置于铁锅中，小火炒至膨胀、开裂，冷却至室温待用[10]。

3.2.1.1 雷公法：称取干燥补骨脂果实100 g，加入适量炮制用酒，浸泡0.5 d后滤出，将补骨脂进入与炮制用酒等量的清水中，浸泡3 d滤出后，置于蒸屉中蒸6 h，晾干待用[11]。

3.2.1.2酒浸法：称取干燥补骨脂果实100 g，加入适量炮制用酒，浸泡0.5 d后滤出，置于铁锅中，小火炒至膨胀、开裂，冷却至室温待用[12]。

3.2.1.3 清炒法：称取干燥补骨脂果实100 g，置于铁锅中，小火炒至膨胀、开裂，冷却至室温待用。

将冷却后的药材经粉碎机粉碎后，过60目筛后即得样品粉末。

3.2.2 供试品溶液配制:精密称取补骨脂样品粉末100 mg至100 ml容量瓶中，加入四分之一体积甲醇，冰域超声30 min使溶解，冷却至室温后用甲醇定容摇匀得供试品储备液。精密移取供试品储备液5.0 ml至10 ml容量瓶中，使用50%甲醇水溶液定容摇匀，经0.45μm尼龙滤膜过滤，即得供试品溶液。

3.3 色谱系统:色谱仪为Waters e2695/2998型高效液相色谱仪。色谱柱：ACUITY UPLC BEH C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，1.7μm)。色谱条件：波长为246 nm、流速为0.4 ml/min、进样量为5μl、进样时间为30 min、柱温为30 ℃。

3.4 线性关系实验：分别精密吸取各对照品储备液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、3 ml置于同一5 ml容量瓶中，用甲醇定容摇匀，即得线性溶液。分别取上述不同浓度的线性溶液采用2.3中色谱系统进样，统计不同浓度下各成分的峰面积，计算各成分浓度(X)与峰面积(Y)的回归方程，线性范围和相对与补骨脂素的分离度，见表1。

表1 补骨脂中抗骨质疏松型指标的线性关系

结果显示，补骨脂中抗骨质疏松各成分(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚)的线性关系良好，r值均≥0.9994，线性范围较宽，各峰相对补骨脂定的分离度均>1.5。

3.5 精密度实验：日内精密度为取样品溶液按照2.3要求连续进样5针，测定补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚峰面积RSD值，见表2。

3.5.1 日间精密度：每天进2针样品溶液，连续3 d共6针，测定补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚峰面积RSD值，见表2。

表2 日内精密度和日间精密度结果(%)

结果显示：经高效液相色谱法测定的补骨脂中抗骨质疏松各成分(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚)的日内精密度和日间精高密度均良好。

3.6 稳定性实验:在配制样品溶液完成后0 h、3 h、8 h、12 h、24 h分别按照3.3中色谱要求进样，测定补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚峰面积RSD值，分别为1.21%、0.98%、1.05%和1.62%，均<2.0%，说明样品溶液在配制后24 h内是均一稳定的。

3.7 重复性实验：精密称取补骨脂粉末100 mg，按照3.2.2项下配制方法平行配制6份样品溶液，按照3.3中色谱要求进样，测定6份样品溶液中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚的峰面积RSD值，分别是0.59%、0.81%、0.57%和0.43%，表明HPLC高效液相法检测补骨脂中各成分结果的重复性较好。

3.8 不同炮制方法检测的含量结果比较：取不同炮制方法制成的平行3份样品溶液，按照3.3中色谱要求进样，记录3份样品中峰面积的平均值，计算不同炮制方法下补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚的含量结果，见表3。

表3 不同炮制方法检测的含量结果比较(mg/g)

3.9 不同炮制方法对各组分含量结果的影响：通过与生品提取物中各成分的比较，比较炮制方法对含量影响情况，见表4。

表4 不同炮制方法对各组分含量结果的影响(%)

本研究结果显示，与生品比较，盐灸法可提升补骨脂素和异补骨脂素含量约1.49%、11.51%，但会造成4.29%的补骨脂定和0.45%的补骨脂酚流失。雷公法可提高补骨脂素和异补骨脂素含量约19.52%和14.50%，但也造成9.51%的补骨脂定和9.98%的补骨脂酚含量降低。酒浸法可提高7.99%的补骨脂素和11.94%的异补骨脂素的含量，4.60%的补骨脂定和1.50%的补骨脂酚含量降低。清炒法对可提高2.35%的异补骨脂素和0.13%的补骨脂酚含量，降低1.67%的补骨脂素和29.45%的补骨脂定的含量。

讨 论

补骨脂主要分布在云南西双版纳、四川金沙江河谷等地，在河北、山西、甘肃、安徽、江西、河南、广东、广西、贵州等省区有栽培，它喜暖润湿气候，喜肥沃之地。中医以种子入药，有壮阳补肾、固精缩尿、肾虚腰痛、小便频数、小儿遗尿、肾漏、温脾止泻、纳气平喘的功效[13]。有多种中医处方中均有此药，它主治肾虚阳痿、腰膝酸软冷痛、肾虚遗精、遗尿或因脾肾阳虚所致的腹泻以及甚虚体寒之症[14]。

补骨脂提取物中补骨脂素、异补骨脂素及补骨脂定均为香豆素类化合物，补骨脂酚为单萜酚类化合物。现代药理学研究表明，补骨脂提取物各种成分均为光敏性化合物，服用后均需辅以日光或者紫外线照射，才能发挥其药效[15]。补骨脂素有光敏、抗癌和止血及舒张平滑肌的作用。胡中花等[16]研究表明，补骨脂素能促E S F-1细胞的分裂和生长，能促进胶原蛋白的合成，表现为潜在的抗皮肤衰老作用异补骨脂素不仅有植物激素样作用，还可促进成骨细胞的分裂和转化。朱振标等[17]研究表明，异补骨脂素可减少小鼠因摘除卵巢引起的股骨下段脂肪细胞增多，且能显著改善其因摘除卵巢而引起股骨下段骨量的丢失。补骨脂定有抗真菌的作用，李静等[18]研究表明，在抗肿瘤细胞增殖实验中，补骨脂定可对多种肿瘤细胞均表现出较强的抑制癌细胞生长分裂作用。补骨脂酚对胆汁运转有积极作用，毕亚男等[19]研究表明，补骨脂酚补骨脂酚能增加钠牛磺酸胆酸共转移蛋白的含量，且连续给药两周也不会对小鼠肝脏造成毒性作用。

本研究中高效液相电子图谱结果表明，异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚相对补骨脂素峰的分离度均>1.5，说明各峰分离良好，彼此峰面积之间无影响。所得补骨脂各提取物浓度和峰面积的回归方程中，异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚的r值均大于0.9994，说明浓度和峰面积的拟合度高，提示两者的线性关系良好。此外，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂酚日内精密度中峰面积RSD均<0.20%，日间精密度中峰面积RSD<2.0%，各成分在室温下24h的峰面积RSD<2.0%，且重复性实验中峰面积RSD均<2.0%，这说明提取物中各成分的浓度相对稳定，高效液相色谱法在测定补骨脂中各成分峰面积结果准确。这些实验都是为了保证后续各成分峰面积测量的准确性，保证含量计算结果可信度。

在建立良好的线性关系，并确定计算结果准确可靠后，本研究将四种不同的炮制方法制得的产品经分析发现，不同的方法对补骨脂中抗骨质疏松成分有着不同的影响。本研究结果显示，雷公法可显著提高补骨脂素、异补骨脂素含量水平；酒浸法可明显提高补骨脂定含量水平、清炒法则对补骨脂酚的含量有较大的提升作用。大量研究表明，补骨脂素和异补骨脂素对促进骨细胞的生长分裂，降低骨量减少有积极作用，因此雷公法较其他炮制方法而言更好，对抗骨质疏松性指标性成分有较大的提升作用，赵根华等[20]研究结果显示，补骨脂苷和异补骨脂苷经雷公法炮制过程中会部分转化成补骨脂素和异补骨脂素，这也佐证了本研究结果。

综上所述，雷公法在炮制补骨脂过程中，对提取物中补骨脂素和异补骨脂素含量的提升作用较为明显，在中医应用中有积极意义。不足之处是在著作《雷公炮制法》中并未明确说明使用何种酒浸泡，不同酒可能对补骨脂中成分的影响不同，后续可探讨使用不同浓度的酒进行雷公炮制法对补骨脂中抗骨质疏松成分的影响。