盐补骨脂对人HK-2、人Hep-G2及猪LLC-PK1的细胞毒性比较分析

王庆涛 高 琛 刘 畅,3 赵红琼 郝智慧*

(1.新疆农业大学 动物医学学院,乌鲁木齐 830052;2.中国农业大学 中兽医药创新中心,北京 100193;3.青岛农业大学 化学与药学院,山东 青岛 266109)

补骨脂又称为破骨脂,是补骨脂干燥的成熟果实。通常用作驱虫药、壮阳药和止泻药,临床一般用于治疗皮肤疾病,如牛皮癣、白皮病、麻风和皮肤炎症性疾病等[1]。近年来,随着对补骨脂不断的深入研究,补骨脂的一些活性成分具有抗炎、增强机体免疫力、抗肿瘤等功效也逐渐被发现[2]。在2015版的《中国药典》中,有41种含有补骨脂的成方制剂被收录[3-4],目前,补骨脂被开发形成的中成药制剂达上百种,在皖西白鹅等动物以及人医临床中现已成为常用的补益类中药,如补肾益脑胶囊、益肾灵颗粒等[5],但是,中国食品药品监督管理局已发布公告称,以补骨脂为主要原料生产的如壮骨关节丸、白蚀丸等中成药可能产生与补骨脂相关的肝损伤等副作用,现已引起国内外研究者和医生对补骨脂的用药问题高度关注[6]。目前,利用各种提取方法对补骨脂的活性成分进行提取,共发现了117种活性成分,其中甲基补骨脂黄酮A、补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂定、补骨脂定、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂甲素含量较多[7]。研究表明,使用盐炙对补骨脂进行炮制的方法,有利于有效成分的煎出[8]。然而在一些研究中显示,补骨脂的主要成分中也具有产生肝肾毒性的物质[7],但是其毒性物质基础往往是多种有毒成分的集合,其组成成分的化学特性各异,具体的毒性成分不明确,在相关研究中也缺乏主要成分对肝、肾毒性作用差异的比较,不能为后续的药物开发或临床应用提供直观性的参考和建议。

本研究以人肾小管上皮细胞(HK-2)、人肝癌细胞(Hep-G2)以及猪肾细胞(LLC-PK1)为评价模型,对比研究盐补骨脂水醇提取物及其主要成分甲基补骨脂黄酮A、补骨脂定、异补骨脂定、异补骨脂素、补骨脂素、异补骨脂定、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂甲素对HK-2细胞、Hep-G2细胞、LLC-PK1细胞的毒性差异,为后续开展补骨脂或补骨脂有效成分的相关研究提供科学依据,在最大程度发挥其药理作用的同时,减少其毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与细胞培养

HK-2、LLC-PK1细胞系购于美国ATCC细胞库、Hep-G2细胞系,购自国家生物医学实验细胞资源库。HK-2细胞在含有体积分数100 U/mL青霉素(PG)、100 mL/L胎牛血清(FBS)、0.1 mg/mL链霉素(SM)的DMEM-F12完全培养液中常规培养、LLC-PK1细胞在含有体积分数100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM、100 ml/L FBS的DMEM-High Glucose完全培养液中常规培养。Hep-G2细胞在含有体积分数100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM和100 ml/L FBS的MEM完全培养液中常规培养。将培养的细胞置于体积分数5%、37 ℃的CO2培养箱中进行培养和传代培养。

1.2 药品、试剂与仪器

盐补骨脂购自中国北京同仁堂有限责任公司。

盐补骨脂醇提取物:使用体积分数为70%的乙醇对打粉后的盐补骨脂进行回流提取,加10倍量溶剂,回流提取时间为2 h,使用8层纱布收集滤液,共3次。合并3次醇提取液,经旋转蒸发仪减压浓缩,备用。

盐补骨脂水提物:盐补骨脂以蒸馏水回流提取,加10倍量水后,浸泡1 h,回流提取3次(间隔时间均为2 h),间隔期间使用8层纱布收集滤液,合并3次水提取液,经旋转蒸发仪减压浓缩,备用。

甲基补骨脂黄酮A、补骨脂素、异补骨脂定、异补骨脂素、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂甲素,均购自成都德瑞克生物科技有限公司,HPLC纯度均为≥98%;磷酸缓冲液(PBS),购自北京启研生物科技有限公司;CCK-8,购自美国MedChemexpress生物科技有限公司。

1.3 检测指标

1.3.1 补骨脂提取物细胞活力测定

取盐补骨脂水提取物、盐补骨脂醇提取物样品适量,经0.22 μm滤膜过滤后,每种成分使用培养基配制成0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的药液。调整细胞密度,HK-2细胞密度为10 000/孔、Hep-2细胞密度为25 000/孔、LLC-PK1细胞密度为10 000/孔,将其接种在96孔板中,37 ℃,5% CO2培养,贴壁生长12 h后使用不含血清的对应培养基,饥饿12 h后,弃掉培养液,给药组加入含补骨脂提取物质量分数为0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的培养基培养24 h。药物处理24 h后,弃掉药液,随后加入100 μL浓度为10%的CCK-8试剂,HK-2细胞和LLC-PK1细胞37 ℃孵育4 h,Hep-G2细胞37 ℃孵育2 h后,使用酶标仪检测吸光度(波长为450 nm),计算细胞存活率后,计算半数抑制率(IC50)。

1.3.2 补骨脂主要活性成分细胞活力测定

取甲基补骨脂黄酮A、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂素、补骨脂宁、异补骨脂素、补骨脂定、异补骨脂定,每种成分以DMSO配制成50 mmol/L浓度的储备液。试验时将其以培养基分别配制成25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L药液,对照组为含体积分数0.4%的DMSO。细胞铺板同1.3.1.1。给药组加入含不同补骨脂的主要成分(25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L)的培养基培养24 h,药物处理24 h后,弃掉药液。随后同1.3.1中使用CCK-8法测定细胞存活率,并计算IC50值。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 9分析软件处理。采用Excel 2021软件进行作图,与对照组相比,*P<0.05表示差异显著,**P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 补骨脂提取物对HK-2细胞活力的影响

给药培养24 h后检测,发现盐补骨脂醇提取物、水提取物能够抑制HK-2细胞的活力。24 h的IC50值显示,在相同给药条件下,盐补骨脂水提取物的IC50值为1.736 mg/mL,盐补骨脂醇提取物的IC50值为0.558 mg/mL。由此可见,盐补骨脂水提取物的毒性小于盐补骨脂醇提取物(图1)。

(a)盐补骨脂水提取物;(b)盐补骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.图1 不同盐补骨脂提取物对HK-2细胞活力的影响Fig.1 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of HK-2 cells

2.2 补骨脂主要成分对HK-2细胞活力的影响

给药培养24 h后检测,发现甲基补骨脂黄酮A、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定、异补骨脂定能够抑制HK-2细胞的活力,而补骨脂宁在本试验剂量下没有显著毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序为(补骨脂宁>补骨脂素>异补骨脂素>异补骨脂定>补骨脂定>甲基补骨脂黄酮A>补骨脂乙素>补骨脂甲素)。24 h的IC50值显示,在相同给药条件下,补骨脂甲素对HK-2 细胞毒性较其他成分对HK-2细胞的毒性强。此外,还比较了补骨脂主要成分与马兜铃酸A对于HK-2细胞的毒性,结果发现甲基补骨脂黄酮A、补骨脂乙素、补骨脂甲素、补骨脂定的毒性强于马兜铃酸A(图2)。

(a)补骨脂素;(b)甲基补骨脂黄酮A;(c)异补骨脂定;(d)异补骨脂素;(e)补骨脂宁;(f)补骨脂定;(g)补骨脂乙素;(h)补骨脂甲素;(i)马兜铃酸A。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Isobavachalcone; (h) Bavachin; (i) Aristolochic acid A.图2 补骨脂主要成分对HK-2细胞活力的影响Fig.2 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of HK-2 cells

2.3 补骨脂提取物对Hep-G2细胞活力的影响

给药培养24 h后检测,发现盐补骨脂醇提取物、水提取物能够抑制Hep-G2细胞的活力。24 h的IC50值显示,在相同给药的条件下,盐补骨脂水提取物的IC50值为3.891 mg/mL,盐补骨脂醇提取物的IC50值为1.049 mg/mL,由此可见,盐补骨脂水提取物的毒性要小于盐补骨脂醇提取物。研究显示,美国每年因对乙酰氨基酚引起的急性肝功能衰竭(AHF)的发生率呈逐年上升趋势(1998年21%,2003年51%)[9],所以对比分析盐补骨脂醇提取物、水提取物和对乙酰氨基酚对于Hep-G2细胞毒性的影响,发现盐补骨脂水提取物的毒性要小于对乙酰氨基酚,但是盐补骨脂乙醇提取物的毒性大于对乙酰氨基酚(图3)。

2.4 补骨脂主要成分对Hep-G2细胞活力的影响

给药培养24 h后检测,发现甲基补骨脂黄酮A、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定、异补骨脂定能够抑制Hep-G2细胞的活力,而补骨脂宁在本试验剂量下基本没有毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序为(补骨脂宁>补骨脂素>异补骨脂定>异补骨脂素>补骨脂定>补骨脂乙素>甲基补骨脂黄酮A>补骨脂甲素)。IC50值显示,在相同给药条件下,补骨脂甲素对Hep-G2细胞毒性较其他成分对Hep-G2细胞的毒性强(图4)。

2.5 补骨脂提取物对LLC-PK1细胞活力的影响

在给药培养24 h后检测,发现盐补骨脂醇提取物、水提取物能够抑制LLC-PK1细胞的活力。24 h的IC50值显示,在相同给药质量分数条件下,盐补骨脂水提取物的IC50值为1.759 mg/mL,盐补骨脂醇提取物的IC50值为0.737 mg/mL。由此可见,盐补骨脂水提取物的毒性要小于盐补骨脂醇提取物(图5)。

(a)盐补骨脂水提取物;(b)盐补骨脂乙醇提取物;(c)对乙酰氨基酚。(a) Water extract salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus; (c) Acetaminophen.图3 不同盐补骨脂提取物对Hep-G2细胞活力的影响Fig.3 Effects of different salt Psoraleae Fructus extracts and acetaminophen on the viability of Hep-G2 cells

(a)补骨脂素;(b)甲基补骨脂黄酮A;(c)异补骨脂定;(d)异补骨脂素;(e)补骨脂宁;(f)补骨脂定;(g)补骨脂甲素;(h)补骨脂乙素。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Bavachin; (h) Isobavachalcone.图4 补骨脂主要成分对Hep-G2细胞活力的影响Fig.4 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of Hep-G2 cells

(a)盐补骨脂水提取物;(b)盐补骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.图5 不同盐补骨脂提取物对LLC-PK1细胞活力的影响Fig.5 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of LLC-PK1 cells

3 讨论与结论

由于中药具有多成分、多途径、多靶点综合作用的整体性特点,其毒性物质基础往往是多种有毒成分的集合,且组成成分的化学特性各异,有些成分毒-效关系不明确,这也增加了中药毒性物质基础研究的难度,需借助有效的方法明确中药毒性物质。

补骨脂最早记载于《雷公炮炙论》,未言明其毒性。但近年来,国内外学者对补骨脂及其制剂肝肾毒性的关注度越来越高[10]。如王宇等[11]发现对鼠使用灌胃的给药方式给予补骨脂乙醇提取物后,相关胆汁合成和转运酶受到破坏,发生胆汁淤积型的肝脏损伤,且补骨脂的毒性呈性别依赖性,对雌性大鼠更易造成肝脏损伤,又如Wang等[12]发现补骨脂甲素等黄酮类成分可通过抑制肝脏微粒体中的葡萄糖醛酸转移酶1A1,从而使胆红素水平升高,造成肝脏毒性。本研究依据补骨脂致肝、肾损害的药理学特点,以HK-2细胞、Hep-G2细胞及LLC-PK1作为研究对象,以细胞活力作为检测指标,对盐补骨脂水、醇提取物及其主要成分对于各细胞的毒性进行评估。结果表明盐补骨脂醇提取物及水提取物可能对肝、肾损伤产生影响,且盐补骨脂醇提取物对于肝、肾细胞的毒性要大于补骨脂水提取物。尤力都孜等[13]和阿卜杜米吉提等[14]研究表明,使用补骨脂乙醇提取物给小鼠灌胃后发现,其肝脏呈现明显的损伤,且郭兆娟[15]在使用水和乙醇对盐补骨脂进行提取后,其盐补骨脂水提取物中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂定等毒性成分明显少于乙醇提取物,含量差异较大,在使用肝细胞对比研究后发现,补骨脂醇提取物对于肝细胞的毒性要大于补骨脂水提取物,其结果与本试验的结果相一致。由此可知,不同的提取方式可能会影响补骨脂的毒性,其原因可能是盐补骨脂在使用乙醇提取后,其毒性成分发生了改变。一些相关研究表明在补骨脂醇提取物中有效成分的含量要高于水提取物[15],在未来的应用中,怎样平衡两者之间的关系,是以后需要进行探讨的问题。

毒性成分方面,甲基补骨脂黄酮A、补骨脂甲素、补骨脂乙素、异补骨脂定、补骨脂定、补骨脂素、异补骨脂素可能是补骨脂致肝、肾细胞损伤的潜在成分,在HK-2细胞和Hep-G2细胞中,补骨脂甲素的毒性均大于补骨脂其他主要成分。在本研究中,虽然使用了2种不同物种细胞进行比较,但是在有毒成分作用的细胞中,都呈现出了剂量依赖性的毒性。研究表明,在使用异补骨脂素灌胃后发现,大鼠的肾脏系数升高,体重减轻,血清中尿素氮含量显著升高,经病理组织学检查后发现,肾脏远曲小管皮质层出现了明显的空泡变性,说明异补骨脂素可引起大鼠肾毒性[16-18],而吴娅丽等[19]使用网络药理学方法筛选补骨脂毒性成分的推测与本研究结果相符。

对乙酰氨基酚是解热镇痛药的一种,过量使用是造成药物性肝损伤主要原因之一[20],而马兜铃酸A是马兜铃酸中主要的组成物质,其靶器官为肾脏,长期使用含马兜铃酸A的药物会导致马兜铃酸肾病,严重时会发展成终末期肾病[21]。本研究对盐补骨脂的提取物与对乙酰氨基酚、补骨脂的毒性成分与马兜铃酸A的毒性分别进行比较后发现其毒性成分中的甲基补骨脂黄酮A、补骨脂乙素、补骨脂甲素、补骨脂定的毒性要大于马兜铃酸A,盐补骨脂乙醇提取物的毒性要大于对乙酰氨基酚,从侧面说明了盐补骨脂及其毒性成分对肝、肾毒性的程度。

因此根据本研究结果,可在后续深入研究其体内外肝、肾损伤及机制和临床应用时,选择合适的有效成分或提取方式,为后续的研究提供科学依据。本研究存在一些局限性,使用HK-2肾小管上皮细胞、LLC-PK1猪肾细胞以及Hep-G2人肝癌细胞进行体外试验并不能完全反映药物对于机体的毒副作用。因此,后续试验将基于以上结果,开展补骨脂水、醇提取物及其主要成分体内毒性的比较及相关的体内外机制方面的研究。此外,一些研究表明,不同动物种属及性别存在药物毒性的差异,后续我们将根据试验结果,开展不同种属、性别方面的研究,为后续深入研究补骨脂毒性及其机制提供试验依据,也为含补骨脂中成药的减毒研究提供思路。

综上所述,盐补骨脂水提取物、醇提取物对HK-2细胞、Hep-G2细胞及LLC-PK1细胞均具有一定的细胞毒性,且盐补骨脂醇提取物毒性更大;补骨脂甲素、补骨脂乙素、甲基补骨脂黄酮A、补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂定、补骨脂定对HK-2细胞、Hep-G2细胞具有一定的细胞毒性,且补骨脂甲素的毒性要大于补骨脂其他主要成分。