大黄活血化瘀作用的HPLC指纹图谱分析*

李付玻 ，王奎鹏， 韩 立 ，郭晓娟 ，房 晓，何 栋

1. 河南省南阳市第一人民医院西药科(南阳 473000)，2.河南中医药大学第一附属医院药学部(郑州450000)， 3.南阳理工学院张仲景国医国药学院(南阳 473000)，4. 河南省开封市医学科学研究所(开封 475000)

主题词 大黄 活血祛瘀 色谱法, 高压液相 @指纹图谱

大黄为临床常见中药之一，源自蓼科植物大黄属干燥根、根茎，以大黄素等蒽醌类衍生物为主要有效成分，发挥导泻、解毒、化瘀、活血等作用[1]。近年来中医药质量控制成为研究热点，对中药大黄质量控制多依据蒽醌类衍生物含量，但实际上并非能对大黄整体特征反映[2]。目前指纹图谱在中药质量评估中发挥重要作用，通过信息采集技术及相关手段获取中药性质图像、光谱等，能综合性、整体性及量化鉴别分析中药材与中成药[3]。由于中药成分复杂多样，部分难以确定，中药指纹图谱“模糊性”与“整体性”特点相比单一或主要成分质量控制法更全面，更满足中药质量控制需求[4]。当下关于中药指纹图谱研究报道较多，但多集中于中药材成分分析[5-6]，而关于其具体功效部位指纹图谱分析研究较少。基于此，本研究对中药大黄活血化瘀作用部位进行指纹图谱分析，现报道如下。

材料与方法

1 实验主要试剂及仪器 甲醇(色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂厂)；纯净水(娃哈哈集团有限公司)；无水乙醇(分析纯，深圳市宏远强科技有限公司)；赛默飞Ultimate3000高效液相色谱仪(上海力晶科学仪器有限公司)；UV-9000波长可调紫外检测器(上海技舟化工科技有限公司)；HH-S6恒温水浴锅(上海玛尼仪器设备有限公司)；电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)；80-2型离心机(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)。

1.1 对照品:大黄素、大黄酚及大黄酸对照品均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 提取物制备：选择大黄1.6 kg，提取溶剂包括氯仿、正丁醇、50%乙醇与水，依次提取10倍量溶剂，提取2次，1次时间60 min，过滤、浓缩提取液，获取相应溶剂提取部位。各部位均为棕褐色固体。临用时按照7∶3比例的植物油、水进行研磨，超声乳化下形成混悬液，将其作为生大黄各部位高剂量组、低剂量组，分别相当于10 g、5 g原生药/kg，为人用剂量20倍、5倍，大鼠灌注用药剂量1 ml/100 g。

2 方 法

2.1 大黄提取物对“血瘀”大鼠的活血化瘀作用：选择SD清洁级大鼠100只，雌雄分别50只，体重平均(300±20)g，随机分为空白对照组、模型对照组、大黄氯仿部位提取物高、低剂量组、大黄正丁醇部位提取物高、低剂量组、大黄50%乙醇部位提取物高、低剂量组、大黄水部位提取物高、低剂量组，每组10只。除空白对照组、模型对照组给予水油(7∶3)混悬液处理外，其他各组给予大黄不同部位提取物高、低剂量混悬液干预，给药剂量均为1 ml、100 g，连续干预1周。最后1次用药后除空白对照组外，其他各组通过大量注射肾上腺素与冰水浸泡构建“血瘀”大鼠模型，12 h后将大鼠股动脉剪开，取血，肝素抗凝，通过血液粘度仪测定各组大鼠全血粘度、红细胞聚集率。

2.2 指纹图谱建立：对照品溶液制备选择合适剂量大黄酸、大黄素及大黄酚对照品，甲醇溶解后制作合适浓度的对照品储备液；选择上述储备液合适容量到25 ml量瓶内，混合均匀，甲醇定容，形成16 μg/ml之标准混合对照品溶液，滤膜过滤后获得续滤液。供试品溶液制备：选择合适剂量的的大黄(大黄饮片，共10批，均源于四川省新荷花中药饮片有限公司)，干燥、粉碎处理后过4号筛选择药材粉末2 g，氯仿、正丁醇、50%乙醇依次提取，相应处理后加甲醇到刻度，摇晃均匀，滤膜滤过后获得供试品溶液。色谱条件：Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)，0.1%磷酸甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)(82∶18)为流动相；流速1 ml/min，检测波长254 nm。对大黄药材供试品进行稳定性实验、精密度实验及重复性实验。

3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件处理数据,计量资料以表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大黄不同部位提取物对“血瘀”大鼠血液流变学的影响 见表1。 与空白对照组比较，模型对照组大鼠全血黏度、红细胞聚集率均明显高(P<0.05)，提示造模成功。与模型对照组比较，大黄正丁醇部位高、低剂量组、大黄50%乙醇部位高、低剂量组大鼠全血粘度、红细胞聚集率均明显低(P<0.05)，其他部位比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血液流变学指标比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05

2 HDLC指纹图谱结果

2.1 稳定性实验：同一供试品溶液制备后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h测定，以主要色谱峰相对保留时间与相对峰面积一致性为观察指标，结果显示其相对标准偏差均<2%，提示供试品溶液24 h内较为稳定。

2.2 精密度实验： 对对照品混合液进行连续进样，共5～6次，以主要色谱峰相对保留时间与相对峰面积一致性为观察指标，结果显示其相对标准偏差均<1%，提示仪器精密度较好。

2.3 重复性实验：选择大黄药材5份按照方法中操作制备供试品溶液，以主要色谱峰相对保留时间与相对峰面积一致性为观察指标，结果显示其相对标准偏差均<2%，提示该方法重复性较好。

2.4 大黄活血化瘀有效部位指纹图谱测定：选择对照品混合溶液、供试品溶液分别15 μl，按照方法中色谱条件进样，对对照品混合溶液、供试品溶液进行指纹图谱测定记录，见图1-2。对10批大黄药材药品相关数据测定，并将其导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件中，计算获取图谱图像，见图3。10批大黄药材相似度分别为0.978、0.995、0.980、0.956、0.975、0.991、0.970、0.974、0.966与0.993，可见样品见相似度较高。

讨 论

大黄在中医用药中使用较多，有清热解毒、活血化瘀、导滞等多种功效。现代药理学研究发现，大黄还有抗肿瘤、镇痛抗炎、抗氧化等作用，其临床应用价值大，受到广大医师的重视[7]。蔡惠芬等[8]研究发现大黄注射液能显著降低血管搭桥术后犬血浆D-二聚体、纤溶酶原激活剂抑制物-1，且与用药剂量相关，提示大黄注射液能明显改善动物搭桥术后血液高凝，预防血栓形成，且呈现剂量依赖性特点。宋雨泽等[9]通过生物效价对生大黄、熟大黄、大黄炭活血化瘀作用测定，结果显示其抗纤维蛋白原生物效价分别为1.4U、2.6U、1.6U，认为熟大黄的活血化瘀作用比其他高。动物实验发现，大黄素能明显改善脓毒症后期大鼠血小板功能，且对P-选择素下调以抗炎，进而发挥肝肾功能保护，减少病死率的目的[10]。为明确大黄活血化瘀功效及其作用部位，我们依据“血瘀”证患者血液流变学改变、寒邪等引发血瘀机理，通过注射大剂量肾上腺素、冰水浸泡构建“血瘀”大鼠。结果显示模型对照组大鼠全血粘度、红细胞聚集率比空白对照组均显著增高，提示“血瘀”大鼠建模成功。同时本研究发现大黄正丁醇部位高、低剂量组、大黄50%乙醇部位高、低剂量组大鼠全血粘度、红细胞聚集率比模型对照组均显著低，而大黄氯仿部位、水部位高、低剂量组与模型对照组比较无显著差异。提示大黄具有活血化瘀功效，且主要于正丁醇、乙醇提取部位表现。

中药指纹图谱以中药基础理论为依据，以现在信息提取技术为重要手段，对中药材品种、质量进行整体分析，具有客观性、“整体性”、“模糊性”特点。临床评价不同中药指纹图谱以相似度为主要指标[11]，根据对照品、供试品指纹图谱计算两者之间的相似度，可参考“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”(国家药典委员会推荐)。通常情况相似度0.9～1.0间多为合格品。我们通过相关系数法计算大黄指纹图谱相似度，相关系数分布在-1与1之间，-1提示2个图谱变化完全相反，1提示2个图谱变化趋势完全一致[12]。窦志华等[13]以对照品指纹图谱作为共有模式，结果发现不同批大黄饮片指纹图谱相似度均在0.9～1.0之间，提示样品间相似度较高，大黄饮片化学成分较为一致。本研究结果显示10批大黄指纹图谱相似度也在0.9～1.0间，可见本研究应用的提取方法、优化色谱条件较为稳定及可靠。同时本研究发现色谱指纹图谱实验方法稳定性、精密度及重复性均较好。本研究筛查出大黄活血化瘀作用部位为乙醇提取物，结果显示大黄活血化瘀作用部位HPLC指纹图谱有7个峰。此外，有研究表明大黄不同饮片、不同产地、不同炮制品HPLC指纹图谱存在差异[14-15]。本研究10批大黄饮片均购自同一厂家，可避免不同厂家对大黄活血化瘀作用HPLC指纹图谱的影响。关于不用产地等大黄HPLC指纹图谱分析有待日后通过多中心研究进一步分析。

综上，大黄活血化瘀药理作用部位主要为正丁醇与乙醇，本研究获取指纹图谱稳定性、仪器精密度、重复性均良好，可作为大黄活血化瘀作用的特征指纹图谱。