石芦清金颗粒质量标准的研究*

蒙麦侠,陈志永,杨智峰, 崔小敏

陕西省中医药研究院(西安 710003)

主题词 @石芦清金颗粒 麻黄碱 色谱法, 高压液相

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD，简称慢阻肺)是一种以气流受限为特征的疾病，其气流受限不完全可逆，呈进行性发展。随全球环境的日趋恶劣，COPD的发生率及死亡率不断升高，据WHO预计到2020年，COPD将跃升至易患疾病的第5位，常见死因第3位。COPD急性发作期病情严重，单纯西医激素及各类气管扩张药物治疗效果不理想，而传统医学对此病认识源远流长，认为COPD属于中医“喘证”、“肺胀”等范畴。COPD急性加重期多因外邪犯肺，郁而化热，热伤肺津，炼液成痰，或素有宿痰，内蕴日久化热，痰与热结，痰瘀互结，壅阻与肺，肺失宣降所致；或因脾虚生痰，或痰热素盛，加之感受外邪，外邪与痰热相合，郁遏肺气，故见发热，气急咳喘，痰热壅肺，气滞不通，故见胸闷胀满等。

石芦清金颗粒由炙麻黄、生石膏、姜半夏、芦根、冬瓜仁、地龙、金荞麦、黄芩、薏苡仁等十三种药味组成，该方是国家名老中医刘华为教授治疗慢性阻塞性肺病多年临床经验总结而成，具有宣肺平喘、清热化痰之功[1-4]，用于慢性阻塞性肺病急性发作期的痰热痈肺型具有很好的疗效，但是该药临床一直以传统汤剂形式应用，汤剂具有煎煮繁琐、难于保存、携带不便及服用量大等缺点，因此为了提高患者用药依从性，结合患病人群特点，将其制成了无糖型颗粒剂；为了评价该颗粒剂制备工艺的稳定和可控性，拟建立其质量评价体系，本实验室通过系统研究，建立了黄芩、薏苡仁、甘草、知母和地龙的薄层鉴别和臣药炙麻黄中止咳平喘有效成分盐酸麻黄碱的含量测定方法。

材料与方法

1 仪 器 LC-2010A HT型岛津高效液相色谱仪；KQ5200DE型数控超声波清洗器；赛多利斯BT25S电子分析天平。

2 试剂与试药 盐酸麻黄碱对照品，批号：171241-201508；薏苡仁油对照提取物，批号：111750-201102；苦杏仁苷，批号：110820-201305；黄芩对照药材，批号：120955-201309；甘草对照药材，批号：120904-201318；芒果苷，批号：111607-200402；芦根对照药材，批号：110855-201412；地龙对照药材，批号：120987-201107；上述对照品及对照药材来自中国药物生物制品鉴定所；石芦清金颗粒为陕西省中医医院自制，批号：171110、171115、171120；甲醇、乙腈为色谱纯，丙酮、乙酸乙酯及磷酸等均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

3 方 法

3.1 薄层色谱鉴别：阴性样品制备按照原有处方分别去除黄芩、薏苡仁、甘草、知母、地龙和炙麻黄后，按照制备工艺制得相应阴性样品。

3.1.1 供试品溶液制备依次称取三批石芦清金颗粒4 g、3 g、8 g、3 g、7 g，顺次加入乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液25 ml、石油醚25 ml、正丁醇25 ml、30%丙酮20 ml和三氯甲烷25 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣依次加入甲醇、石油醚、正丁醇、30%丙酮和三氯甲烷各2 ml，得黄芩供试品溶液、薏苡仁供试品溶液、甘草供试品溶液、知母供试品溶液和地龙供试品溶液。

3.1.2 阴性样品和对照药材溶液制备：照供试品溶液处理方法，制成黄芩、薏苡仁、甘草、知母和地龙阴性样品溶液，黄芩、甘草、地龙对照药材溶液。

薄层色谱鉴别方法照中国药典2015版四部0502薄层色谱法进行。

3.1.3 黄芩TLC鉴别[5]：吸取黄芩3批供试品溶液、对照药材溶液和阴性样品溶液各2 μl，照操作方法进行实验，用乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶10∶1∶2)混合溶液展开，取出晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应Rf值处，有相同颜色斑点，且阴性样品无干扰，结果见图1A。

3.1.4 薏苡仁TLC鉴别[6]：取薏苡仁油对照提取物，加石油醚(60～90℃)制成每1ml含2mg的溶液，作为对照提取物溶液。吸取薏苡仁3批供试品溶液、阴性样品溶液和薏苡仁对照提取物溶液各2μl，照操作方法进行实验，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶1∶0.1)混合溶液展开，取出晾干，均匀喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液(需临用现配)，置105 ℃加热至色谱斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应Rf值处，显相同颜色的蓝色斑点，且阴性样品无干扰，结果见图1B。

3.1.5 甘草TLC鉴别[6]：吸取甘草3批供试品溶液、对照药材溶液和阴性样品溶液各2μl，照操作方法进行实验，用三氯甲烷-甲醇(8∶2)的混合溶液展开，取出晾干，均匀喷以10%硫酸乙醇溶液，置105℃加热至色谱斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应Rf值处，显相同颜色的黄色斑点，且阴性样品无干扰，结果见图1C。

3.1.6 知母TLC鉴别[6]： 取芒果苷对照品适量，制成每1 ml含0.5 mg的稀乙醇溶液，作为对照品溶液。吸取知母3批供试品溶液、对照药材溶液和阴性样品溶液各5μl，照操作方法进行实验，用乙醇-水(1∶1)的混合溶液展开，取出晾干。置365 nm的紫外光灯下观察，供试品色谱中，在与对照品色谱相应Rf值处，显相同颜色的黄色荧光斑点；或均匀喷以1%的三氯化铁乙醇溶液，日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应Rf值处，显相同颜色蓝色斑点，且阴性样品无干扰，结果见图1D、E。

3.1.7 地龙TLC鉴别[6]：吸取地龙3批供试品溶液、对照药材溶液和阴性样品溶液各2μl，照操作方法进行实验，用丙酮-甲苯(1∶9)的混合溶液展开，取出晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应Rf值处，显相同颜色的蓝色荧光斑点，且阴性样品无干扰，结果见图1F。

A.黄芩；B.薏苡仁；C.甘草；D.知母荧光、E.知母日光；F.地龙1、2、3-供试样品；4-对照药材或对照品；5-阴性样品

3.2 含量测定[7-9]:流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1.2∶3∶95.8)；色谱柱：Inertsil ODS-3 C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；检测波长：210nm；流速：1.0 ml/min；理论塔板数：以盐酸麻黄碱计不低于3000。

3.2.1 对照品溶液的制备：精密称取适量盐酸麻黄碱，制成每1 ml含0.0438 mg的甲醇溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备：取石芦清金颗粒约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 ml 1.44%的磷酸甲醇溶液，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用上述溶液补足减失的重量，滤过，取续滤液用0.45 um的微孔滤膜过滤，即得。

3.2.3 阴性样品溶液的制备：取炙麻黄阴性样品约1 g，精密称定，同供试品处理方法处理，得炙麻黄阴性样品溶液。

3.2.4 系统适用性实验：分别精密吸取三种溶液10 μl，注入液相色谱仪，按色谱条件检测，记录色谱图。由图谱可知，在盐酸麻黄碱对照品出峰位置，供试品溶液有相应的色谱峰出现，与其相邻色谱峰分离度良好；阴性样品溶液色谱图中，在与对照品色谱图主峰位置，无对应色谱峰出现，说明样品中其余组分对盐酸麻黄碱含量测定无干扰(图2)。

A:标准品; B:供试品;C:阴性样品;1:盐酸麻黄碱

3.2.5 线性范围考察：精密称取盐酸麻黄碱对照品适量，制成每1 ml含0.1028 mg的甲醇溶液；精密吸取上述溶液2、4、6、8、10、12 μl，按色谱条件测定，并以盐酸麻黄碱含量和峰面积进行回归分析，结果表明盐酸麻黄碱在0.2056～1.2336 μg范围内线性关系良好，回归方程为y=2170691x+25111(r=0.9997)。

3.2.6 精密度实验：精密连续吸取盐酸麻黄碱标准溶液6次，每次10 μl，按色谱条件测定，计算盐酸麻黄碱峰面积和变异系数，结果RSD为1.55%，表明仪器精密度良好。

3.2.7 提取方法考察：取供试品5份，每份约1.0 g，精密称定，置磨口三角瓶中，分别精密加入1.44%的磷酸甲醇溶液25 ml，称定重量，其中1至4份超声提取相应时间，第5份加热回流提取30 min，提取后，放冷，再次称定重量，用1.44%的磷酸甲醇溶液补足减失的量，滤过，取续滤液用0.45 um的微孔滤膜滤过，即得。结果表明：加热回流提取30 min，样品中盐酸麻黄碱提取率为最高，故确定提取方式为回流提取30 min，结果见表1。

表1 提取完全性试验结果

3.2.8 重现性实验:取同一批号的石芦清金颗粒，按供试品溶液制备方法平行制备6份样品，按色谱条件测定6份样品中盐酸麻黄碱含量，结果6份样品平均含量为1.30 mg/g，RSD为1.91%，表明操作过程重现性良好。

3.2.9 稳定性实验: 分别于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取同一供试品溶液10 μl，进样测定，考察盐酸麻黄碱峰面积积分值在24 h内的变化，结果表明在24 h内基本稳定，RSD为0.85%。

3.2.10 加样回收率实验:精密称取已知含量的石芦清金颗粒6份，每份0.5g，再分别精密加入盐酸麻黄碱标准品溶液(浓度：0.1534 mg/ml)5 ml和 1.44%的磷酸甲醇溶液20 ml。按供试品溶液制备方法制成加样供试品溶液，测定盐酸麻黄碱含量，计算回收率，实验结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

3.2.11 样品含量测定:分别称取3批样品各约1 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，照色谱条件测定，计算样品中盐酸麻黄碱含量，试验结果见表3。

表3 三批样品测定结果

讨 论

薏苡仁薄层鉴别时，先选用现行版药典薏苡仁项下展开系统石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(83∶17∶1)，结果需检出薄层斑点Rf值偏大，调整为石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶1∶0.1)时Rf值适中，故标准中采纳。知母薄层鉴别时，以知母皂苷BⅡ标准品为对照，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，香草醛硫酸试液显色，结果阴性对照有干扰；参考文献方法，供试样品处理时加适量盐酸水解后，以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂，喷以5%的香草醛硫酸乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视，未发现文献报道的荧光斑点；在以芒果苷标准品为对照，聚酰胺薄膜为固定相，乙醇-水(1∶1)为展开剂时，结果在紫外灯(365 nm)下检视供试品色谱中与芒果苷对照品处有相对应的薄层斑点出现，且阴性样品无干扰，此方法采纳。桃仁[10-11]中的苦杏仁苷因遇热不稳定，芦根[12]在薄层鉴别中与金荞麦相互有干扰，故三者的薄层鉴别方法经试验研究未能建立。

生石膏为方中君药，现行版药典规定用酸碱滴定法测定含水硫酸钙的含量，因中药成分复杂，复方提取液颜色较深，滴定过程中指示剂颜色变色很难准确判定，故以臣药炙麻黄中有效成分盐酸麻黄碱为含量控制指标，经方法学考察和对三批样品的测定，同时考虑中药材批次之间的差异性，最终确定石芦清金颗粒中含炙麻黄以盐酸麻黄碱计每克不得少于1.04 mg。