阳和汤对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及其Akt/mTOR信号通路的影响*

黄 芊，张扶莉，李雪莲，尚荣国，许崇文，钱建升，窦建卫△

1.西安市中医医院(西安 710021)，2.西安交通大学医学部(西安 710061),3.西安交通大学第一附属医院 (西安 710061)

主题词 乳腺肿瘤/中医药疗法 阳和汤/治疗应用 动物实验 大鼠

在我国，女性乳腺癌发病率已居女性恶性肿瘤发病率的首位，且呈逐年上升态势，患病年龄趋于年轻化[1]。清代王维德认为，乳岩“初起乳中生一小块，不痛不痒，症与瘰疬、恶核相若，是阴寒结痰。”提出“以阳和汤加土贝母五钱煎服”的温阳补血、散寒解凝的治疗法则。由此可知，辨证为阳虚、寒痰凝聚的乳腺癌可用阳和汤治疗，其效不差。

研究表明，蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Protein Kinase B/the mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR)信号通路具有调节细胞增殖、分化的作用。在乳腺组织中，该通路的异常活化可导致乳腺癌的发生、发展[2]。

本研究基于Akt/mTOR信号通路，通过阳和汤干预人乳腺癌MDA-MB-231细胞，探索阳和汤对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及其Akt/mTOR信号通路的影响。

材料与方法

1 细胞株 MDA-MB-231细胞，购自上海和元生物技术公司。

2 实验动物 SPF级，SD雌性大鼠，体质量250～300 g，12只，由西安交大动物中心提供，使用许可：SYXK(陕)2015-002。

3 主要药物和试剂 中药购于西安市雁塔区老百姓大药房，据《中国药典(2015版)》鉴定合格。阳和汤煎制、浓缩、减压干燥成浸膏，相当于原生药5 g/g，4℃保存。5-FU针液(规格:10 ml∶0.25 g)，上海旭东海普(国药准字：H31020593)。胎牛血清(Gibco，Lot No. 1776593)，高糖培养基(Gibco，Lot No. 8116256)，0.25%胰酶(Gibco，Lot No. 1742078)，CCK-8试剂盒(凯基生物，Lot No. AR1160-500)，细胞凋亡试剂盒(凯基生物，Lot No. m86413)，p-Akt一抗(CST，Lot No. 9271)，p-mTOR(CST，Lot No. 9637)，Bcl-2(CST，Lot No. 9651)，bax(CST，Lot No. 9843)等。

4 主要仪器 BX 53倒置荧光显微镜，OLYMPUS公司；HT2型酶标仪，Thermo公司；Labofuge台式离心机，Heraeus公司；HC-3018超速冷冻离心机，科大创新；Epice-XLⅡ型显影仪，BD公司,等。

5 实验方法

5.1 含药血清的制备[3]：12只大鼠，按随机均分为两组(空白对照组、阳和汤组)。阳和汤组大鼠按18 g/kg(相当于临床用量20倍)的剂量灌胃给药，空白对照组灌胃蒸馏水。各组灌胃体积按10 ml/kg计算。各组灌胃给药每日2次(上、下午定时各1次)。连续给药3 d，腹主动脉取血，离心，制备血清，-80℃保存。阳和汤高剂量含药血清为制备血清，低剂量组含药血清为制备血清加等量高糖培养基稀释而成。实验时，用含10%制备(含药)血清的高糖培养基干预细胞。

5.2 细胞培养与传代：37 ℃，5% CO2，用含10%胎牛血清的高糖培养基陪养细胞。0.25%的胰酶消化。

5.3 细胞增殖检测：取1×105/ml细胞悬液，接种到3块96孔板上(100 μl/孔)，每板分设空白，阳和汤低、高剂量，阳性药和阴性组(每组设6个复孔)。24 h后，吸弃培养基。空白，阳和汤低、高剂量组分别用对应血清干预，阳性药物组用5 μg/ml 5-Fu干预，阴性组用含10%胎牛血清的高糖培养基干预(200 μl/孔)。于24、48、72 h分别取出一块板，试验各孔加20 μl CCK-8溶液，3 h后，酶标仪检测各孔吸光度(OD)，计算各组平均吸光度。

细胞生长抑制率=[1-(给药组平均OD值-阴性组平均OD值)/(相对空白对照组平均OD值-阴性组平均OD值)]×100%

5.4 流式细胞术检测凋亡：取对数期1×105/ml细胞悬液，接种到6孔板上，每孔2 ml，设空白，阳和汤低、高剂量，阳性药物组，24 h后，吸弃培养基。空白，阳和汤低、高剂量组用对应血清干预，阳性药物组用5 μg/ml 5-Fu干预24 h后。按照细胞凋亡试剂盒说明书，流式细胞仪检测。

5.5 Western blot检测蛋白表达：细胞接种同5.4。空白，阳和汤低、高剂量组用对应血清干预，阳性药物组用5 μg/ml 5-Fu干预24 h后。裂解细胞，离心，收集上清液，BCA法检测蛋白浓度，将上清液制成上样液，-20℃保存。电泳(上样量20 μg/孔)，转膜、封闭，一抗溶液孵育，4℃过夜。次日洗膜，二抗溶液孵育，洗膜，显影。β-actin为参照蛋白。运用Image J软件对条带灰度进行定量分析。

6 统计学方法 SPSS 18.0软件分析数据，定量资料表示为均数±标准差，两组间比较用t检验，多组间采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 阳和汤对MDA-MB-231细胞增殖的影响 干预24、48、72 h后，与空白对照组相比，阳和汤低、高剂量组和阳性药物组细胞抑制率分别均增高(P< 0.01)(图1)。

注：与空白对照组相比，** P<0.01

2 阳和汤对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 干预24 h后，与空白对照组相比，阳和汤低、高剂量组和阳性药物组细胞的凋亡率均增加(P<0.01)(图2)。

注：与空白对照组相比，**P<0.01

3 阳和汤对MDA-MB-231细胞Bcl-2、Bax表达的影响 干预24 h后，与空白对照组相比，阳和汤低、高剂量组和阳性药物组Bcl-2表达均降低(P<0.05或0.01)；Bax表达均增加(P<0.05或0.01)；与空白对照组相比，Bcl-2与Bax比值均降低(P<0.01)(图3)。

注：与空白对照组相比，* P<0.05，*P<0.01

4 阳和汤对MDA-MB-231细胞Akt、mTOR的影响 干预24 h后，与空白对照组相比，阳和汤低、高剂量组和阳性药物组p-mTOR表达均降低(P<0.05或0.01)，total mTOR表达无影响(P>0.05)；mTOR磷酸化率均降低(P<0.05或0.01)。干预24 h后，与空白对照组相比，阳和汤低、高剂量组和阳性药物组p-Akt表达均降低(P<0.05或0.01)，total Akt表达无影响(P>0.05)；Akt磷酸化率均降低(P<0.01)(图4)。

注：与空白对照组相比，* P<0.05，**P<0.01

讨 论

乳腺癌主因阳气亏虚，七情内伤或外邪袭表以致脏腑功能失常、冲任失调，气血瘀滞、寒痰凝聚，邪毒结聚于乳而成[4]，其病多为阳气亏虚、寒痰凝聚，治应温阳补血、散寒解凝。阳和汤重用熟地，补血益髓；鹿角胶，补肾助阳，共为君药。姜炭、肉桂温热，为臣。姜炭温中通阳，肉桂温通血脉。麻黄通络而散寒结，白芥子祛痰，为佐。甘草生用，解毒而调诸药，为使。全方补血温阳，化痰通络。治疗乳腺癌，标本兼顾。

体内、外研究表明阳和汤具有抗乳腺癌的作用。阳和汤可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导凋亡[5]；可抑制MDA-MB-231细胞的增殖，减少NF-κB、IL-8表达[6]。阳和汤可抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生长[7]，减少CD90、MMP-9、IL-6表达[8-9]，具有抑制移植性人乳腺癌骨转移的作用[10]。

在乳腺癌细胞中，Akt/mTOR信号通路的异常活化，可促进乳腺癌增殖、转移、抗凋亡和耐药的产生。Akt又称蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)可通过多种途径磷酸化(活化)下游靶蛋白，如Caspase-9、NF-κB、mTOR和Forkhead等[11]。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可受多种细胞信号调节，而Akt是mTOR信号传导的重要上游信号分子[12]，活化的Akt可直接活化mTOR。此外，活化的Akt还可抑制抑癌蛋白(The tumor-suppres-sorproteins，TSC1)与结节性硬化症复合蛋白(Tuber-ous sclerosis complex proteins，TSC2)结合，间接促进mTOR活化，从而促进乳腺癌细胞的增殖、抑制其凋亡。

Bcl-2是最主要的抑制凋亡蛋白，Bax是最主要促进凋亡的蛋白。在乳腺癌细胞中，Bcl-2表达增加，Bax表达降低，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[13]。Bcl-2/Bax值增大，可抑制细胞凋亡。

本次实验结果显示，阳和汤可抑制MDA-MB-231细胞的增殖，诱导细胞凋亡，降低Bcl-2/Bax值；降低Akt、mTOR磷酸化率，抑制Akt、mTOR的活化，从而抑制Akt/mTOR信号通路的活化。因此，阳和汤治疗乳腺癌的作用机制可能是通过抑制Akt/mTOR信号通路的活化，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导其凋亡，发挥抗癌作用。