扶正解毒化瘀颗粒对克雷伯杆菌肺炎所致多器官功能损伤小鼠心肌组织细胞因子及病理的影响研究*

李 猛, 王志梅, 徐红日, 王成祥, 马战平

1. 陕西省中医医院(西安 710000)，2. 陕西中医药大学(咸阳 712000)，3. 北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)

主题词 肺炎/中医药疗法 肺炎克雷伯菌 @扶正解毒化瘀颗粒 动物实验 小鼠

肺炎克雷伯杆菌肺炎(Klebsiellar pneumonia,KP)是临床常见的感染性疾病，老年人及免疫功能低下者容易罹患，是诱发全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、造成多器官损伤或多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要原因[1]，心肌损伤和功能不全是其病理改变的关键因素。机体感染后，释放大量细胞因子，激活各种炎症细胞，多种炎症介质失控性释放，并呈“级联放大”，诱导过度炎症反应，引起心肌细胞凋亡、抑制心肌收缩功能，导致心肌损害[2]。中医药在保护心肌功能、提高心肌细胞氧含量、增加组织血供、改善微循环等方面作用明显[3]。扶正解毒化瘀颗粒具有清热解毒、活血化瘀、益气养阴的功效，用于治疗老年肺炎疗效显著[4-5]。现以克雷伯杆菌肺炎所致多器官功能损伤模型小鼠为研究对象，通过观察不同感染时相心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10的表达水平及心肌组织病理学的变化，揭示扶正解毒化瘀颗粒对克雷伯杆菌肺炎所致多器官功能损伤小鼠心肌组织的保护机制，为进一步临床应用提供实验依据。

材料与方法

1 动 物 SPF级KM雄性小鼠128只，鼠龄4周，体重(20±5)g，由河南省实验动物中心提供(合格证号XK20110013)。标准饲养，自由饮水。

2 药 品 肺炎克雷伯杆菌由中国生物制品检验鉴定所提供(菌株号:K46114)，使用前用无菌生理盐水稀释至1.0×103CFU/ml。盐酸左氧氟沙星胶囊由扬子江药业集团有限公司提供(国药准字H19990051)，用纯水配制成终浓度为4 mg/ml的溶液；扶正解毒化瘀颗粒由瓜蒌、败酱草、薏苡仁各30 g，黄芩、连翘、漏芦、赤芍各15 g，西洋参6 g组成，药物由河南中医药大学第一附属医院制剂室提供，采用免煎颗粒剂，用纯水配制成终浓度为1.84 g/ml的溶液。

3 主要试剂与仪器 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α(批号：EK0527)、白介素(Interleukin，IL)-1β(批号：EK0394)、IL-6(批号：EK0411)、IL-10(批号：EK0417)、干扰素(Interferon，IFN)-γ(批号：EK0375)、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒由武汉云克隆科技股份有限公司提供。苏木素-伊红(Htoxylin eosin，HE)染色试剂盒(批号：G1120)由北京索莱宝科技有限公司提供。

TP1020全自动组织脱水机、EG1150石蜡包埋机、RM2145型自动切片机(Leica，德国)；OLYMPUS-DP70型显微镜及显微照相系统(奥林巴斯，日本)；Image-Pro Plus6.0专业图像采集及分析系统(Media Cybernetics，美国)；UV-260自动分光光度计(岛津，日本)。

4 方 法

4.1 分组与造模：128只小鼠称重，随机分为对照组、模型组、西药组、中药组，每组32只。参照文献提供的造模方法[6-7]，用10%水合氯醛(0.1 ml/10g)腹腔麻醉小鼠，套管针经喉部行气管插管，注入提前备好的菌液0.1 ml(103CFU/ml)。对照组同法注入等量的无菌生理盐水。动物模型成功标准参照文献进行判断[8]，本实验通过观察小鼠一般情况、理化指标以及病理变化，证实造模成功(另文发表)。

4.2 给药：于造模前3天对中药组、西药组小鼠进行药物干预，按体重换算成小鼠每日用药剂量[0.01 ml/(g·d)]，中药组、西药组分别灌服中药溶液、西药溶液，对照组、模型组灌服生理盐水，1次/d。

4.3 取材与指标检测：每组分别于造模后第1、3、5、7天各取8只小鼠，小鼠处死后，开腹、开胸取出心脏；纵切心脏组织，一部分组织用4%多聚甲醛固定液固定，待做HE染色；另一部分组织按1∶10加入生理盐水后充分匀浆，分离上清液，放入-80 ℃冰箱中保存待测TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平；操作严格按照产品说明书进行。

检测：采用ELISA法，检测小鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平(单位：pg/ml)；取固定好的心肌组织，用4%多聚甲醛固定液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋，切成4 μm厚的切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各脏器组织病理学改变。

5 统计学方法 所有数据用SPSS 22.0软件进行统计处理，以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 四组心肌组织TNF-α比较 见表1。与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，心肌组织TNF-α的含量显著增高(P<0.05)；与模型组比较，中药组小鼠在感染后第1天，心肌组织TNF-α的含量显著降低(P<0.05)；与西药组相比，中药组小鼠在不同感染时相，心肌组织TNF-α的含量无统计学差异(P>0.05)。

表1 不同感染时相小鼠心肌组织TNF-α的表达(pg/ml)

注:与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2 四组心肌组织IL-1β比较 见表2。与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1天，心肌组织IL-1β的含量显著增高(P<0.05)；与西药组相比，中药组小鼠在不同感染时相，心肌组织IL-1β的含量无统计学差异(P>0.05)。

表2 不同感染时相小鼠心肌组织IL-1β的表达(pg/ml)

注:与对照组比较，*P<0.05

3 四组心肌组织IL-6比较 见表3。与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1天，心肌组织IL-6的含量显著增高(P<0.01)；与模型组比较，中药组小鼠在感染后第1天，心肌组织IL-6的含量显著降低(P<0.05)；与西药组相比，中药组小鼠在不同感染时相，心肌组织IL-6的含量无统计学差异(P>0.05)。

表3 不同感染时相小鼠心肌组织IL-6的表达(pg/ml)

注:与对照组比较，∆P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

4 四组心肌组织IFN-γ比较 见表4。与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，心肌组织IFN-γ的含量显著增高(P<0.05)；与西药组相比，中药组小鼠在不同感染时相，心肌组织IFN-γ的含量无统计学差异(P>0.05)。

表4 不同感染时相小鼠心肌组织IFN-γ的表达(pg/ml)

注:与对照组比较，*P<0.05

5 四组心肌组织IL-10比较 见表5。与对照组比较，模型组小鼠在感染后第1、3天，心肌组织IL-10的含量显著增高(P<0.05)，中药组、西药组小鼠在感染后第1、3、5、7天，心肌组织IL-10的含量显著增高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，中药组小鼠在感染后第1天，心肌组织IL-10的含量显著升高(P<0.05)；与西药组相比，中药组小鼠在不同感染时相，心肌组织IL-10的含量无统计学差异(P>0.05)。

表5 不同感染时相小鼠心肌组织IL-10的表达(pg/ml)

注:与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

6 四组小鼠心肌组织病理改变 造模后第1天，对照组小鼠心肌组织大致正常(见图1A)；模型组小鼠心肌纤维断裂、排列紊乱，间质纤维组织增生，小血管周围可见大量炎症细胞浸润(见图1B)；西药组小鼠心肌组织病理情况较模型组有所减轻(见图1C)，与中药组差别不大；中药组小鼠部分心肌纤维断裂、排列紊乱，毛细血管扩张充血，小血管周围可见中等量炎症细胞浸润(见图1D)。

造模后第3天，对照组小鼠心肌组织大致正常(见图2A)；模型组小鼠部分心肌纤维断裂、排列紊乱，可见间质纤维组织增生，小血管周围可见中等量炎症细胞浸润(见图2B)；西药组、中药组小鼠少部分心肌纤维断裂、排列紊乱，可见毛细血管扩张充血，小血管周围可见少量炎症细胞浸润，但较模型组有所减轻(见图2C、图2D)。

造模后第5天，对照组小鼠心肌组织大致正常(见图3A)；模型组小鼠少部分心肌纤维断裂、排列紊乱，小血管周围可见少量炎症细胞浸润(见图3B)；西药组、中药组小鼠心肌组织病理情况较模型组有所减轻(见图3C、图3D)。

造模后第7天，对照组小鼠心肌组织大致正常(见图4A)；模型组、西药组、中药组小鼠心肌组织病变情况基本恢复正常(见图4B、图4C、图4D)。

讨 论

老年人细菌性肺炎过程中，内毒素诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远超过内毒素本身对机体的直接影响，因其诱发的细胞因子可引发一系列“瀑布样级联效应”，从而造成多器官损伤，导致多器官功能障碍综合征(MODS)的发生。在MODS所表现的病理过程与中医热邪、毒邪郁闭和损伤脏腑等病理改变极其类似[9]。叶天士所论述的“温邪上受，首先犯肺，逆传心包”也揭示了这一传变过程[10]。心脏作为MODS常累及的靶器官，在MODS患者常常出现不同程度的心功能障碍或心力衰竭,而心功能障碍又是MODS病情加重及死亡的危险因素[11]，细菌毒素激活的失控的介质网络,最后可导致心功能衰竭和死亡。

在MODS发生过程中，细胞因子被认为是罪魁祸首，促炎-抗炎细胞因子网络失衡起了关键作用。MODS的始动因素类似中医学的“毒邪”，“热毒炽盛”是邪正交争而引起的主要病机变化[12]，反映了“炎性因子异常增高、免疫反应激烈”的病理过程。TNF-α是炎症因子瀑布效应的关键因子，可直接损伤冠状动脉血管，使心肌细胞供血减少，并通过诱发IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，损伤血管内皮细胞，使血管壁通透性增加，损伤心肌细胞[13-15]。研究发现心衰患者TNF-α、IL-6、IL-1均高于正常人，且与心功能级数成正相关，与射血分数成负相关[16]。IFN-γ过量产生可激活单核-巨噬细胞，促进炎性细胞因子的产生，加重炎症反应[17]。本实验结果显示：模型组小鼠在感染后第1、3天，心肌组织TNF-α、IFN-γ、IL-10的含量显著增高，IL-1β、IL-6的含量在感染后第1天显著增高，提示机体感染后，释放大量炎症介质和细胞因子，引起炎症级联反应，形成SIRS，最终导致MODS，为了拮抗炎症介质，抑制过度炎症反应，自身免疫发挥调节作用，促炎因子随之大量产生。

本实验结果显示：与模型组比较，中药组小鼠在感染后第1天心肌组织中TNF-α、IL-6的含量显著降低，提示扶正解毒化瘀颗粒可能通过降低促炎细胞因子表达减轻炎症反应，从而发挥心脏保护作用。现代药理作用研究表明，黄芩苷可降低肺炎衣原体刺激细胞产生的IL-8，在降低TNF-α、IL-6方面效果也很显著[18-19]；黄芩提取物可干预CVB3m的复制, 对心肌具有一定的保护作用[20]。连翘煎煮液能够降低大肠杆菌感染模型小鼠血清中IFN-γ、IL-4 水平，对感染模型小鼠起到保护作用[21]。败酱草能明显抑制脂多糖刺激枯否氏细胞分泌粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子，减轻炎症反应[22]。薏苡仁酯可有效抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的产生，增加抗炎细胞因子IL-10产生,抑制内皮细胞炎症反应[23]。瓜蒌提取液具有一定的抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤等作用[24]。

IL-10具有拮抗促炎介质和调节机体免疫功能的生物学特性，可减轻中性粒细胞介导的炎性浸润，减轻心肌损伤，发挥心肌保护作用；可通过抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β等的过度表达，在缺血再灌注损伤中发挥重要的保护作用[25-26]。本实验结果显示：与模型组比较，中药组小鼠在感染后第1天心肌组织中IL-10的含量显著增高，提示扶正解毒化瘀颗粒可能通过提高IL-10等抗炎细胞因子表达降低机体炎症反应，减轻组织损伤。心肌组织病理结果显示，中药组小鼠心肌组织病理损伤程度较模型组减轻，提示扶正解毒化瘀颗粒对MODS小鼠心肌组织也具有一定保护作用。现代药理作用研究表明，连翘水煎液能够提高大肠杆菌感染模型小鼠血清IL-10表达和IFN-γ/IL-4比值，提高小鼠的免疫调节功能[21]。漏芦提取物能够维持心肌细胞脂膜稳定性、维持细胞结构与功能，对心肌细胞具有保护作用[27]。薏苡仁水提液能够增强免疫抑制小鼠体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能[28]。瓜蒌皮、赤芍总苷能促进小鼠免疫功能，调节免疫系统的失衡[29-30]。西洋参茎叶总皂苷可活化巨噬细胞，增强其吞噬能力，并产生生物活性物质从而增强机体的免疫功能[31],并可通过抑制活性氧的增加及减少炎症反应的发生，有效的减弱心肌缺血再灌注引起的损伤[32]。另外，本实验结果显示：与西药组比较，中药组小鼠在不同感染时相心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平无显著差异，但TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ整体水平低于西药组、IL-10水平高于西药组，且中药组心肌组织病理损伤程度稍轻于西药组，提示中药组在降低促炎细胞因子水平、提高抗炎细胞因子、保护心肌组织等方面作用与西药组无明显差异。

MODS的中医药治疗主要采取清热解毒、活血化瘀、通腑泻下、扶正固本等治法[33]。临床和实验研究均发现清热解毒类、活血化瘀类及多数补益类中药及其提取成分具有免疫增强或免疫调节作用，对细胞因子可产生不同的影响[34]。本实验中发现扶正解毒化瘀颗粒对于“炎性因子异常增高、免疫反应激烈”的干预作用，与国内其他学者研究结果类似，如李建生等[35]报道中药复方毒素清可通过阻抑心肌组织TNF-α、IL-1、巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)蛋白表达、MIP-2 mRNA表达，对老年肺炎心肌损伤起到保护作用。

综上所述，扶正解毒化瘀颗粒紧扣“热毒炽盛”的病机，早用“清热解毒”阻断热毒闭肺、逆传心包的疾病进展过程，选用黄芩为君药，以清上、中、下三焦之热,尤长于清肺热；臣药连翘、漏芦清热解毒、散结排脓，与君药配合以达清热解毒排脓的作用；败酱草和薏苡仁常作对药使用，以上清肺热、下清大肠，热邪得解；瓜蒌清热化痰兼滑肠，使邪热有去路，以解邪热之毒；佐以赤芍凉血散瘀，所谓瘀消血行则热散，与黄芩、连翘配合增强清热凉血、活血消痈作用；西洋参益气养阴，以达扶正祛邪之效。扶正解毒化瘀颗粒能够抑制克雷伯杆菌肺炎所致多器官功能损伤小鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎细胞因子的过度表达，同时能提高抗炎细胞因子IL-10的表达水平，以减轻由“促炎-抗炎细胞因子网络失衡”所导致的心脏局部炎症反应，减轻心肌组织的损伤程度，从而对心肌组织起到一定的保护作用。这对进一步阐明扶正解毒化瘀颗粒干预MODS的作用机制具有一定的意义。