酱油选育菌种制曲条件的优化研究

万萍，周琳，孙杰，吴枚枚，段献银，刘达玉

(成都大学 药学与生物工程学院，成都 610106)

酱油作为中国传统发酵食品，历史悠久，兼具色、香、味，并且营养丰富，是中国百姓生活中不可缺少的调味品之一。经过几千年的改进与创新，我国酱油生产已经有了很大的发展，整个酿造工艺也不断趋于完善。然而，目前我国酱油酿造业与日本相比仍具有较大差距。我国酱油生产仍然面临产品质量不高、成曲质量不良、原料转化率低、发酵周期长等问题。这些问题的存在，严重制约了我国酱油行业的发展和国际竞争力的提升。优良菌种及其优质成曲是提高酱油质量的关键。影响制曲的因素主要有生产菌种、原料选择、水源质量、浸泡时间、蒸煮时间、焙炒条件、温度情况、湿度情况、通风情况、翻曲情况、制曲时间等[1-4]。本文采用选育性能良好的酱油专用菌种，首先分析制曲过程中影响成曲品质的因素，在分析各制曲影响因素的基础上，设计正交试验进一步优化酱油制曲工艺及其主要参数，以期提高种曲质量，尤其是提高蛋白酶、糖化酶的活力，进而提高蛋白原料的利用率。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

四川大豆、标准面粉、麸皮:由自贡天味食品有限公司与富顺美乐食品有限公司提供；米曲霉A3-U12:通过改良双层酪蛋白培养基进行选择，分离出优良的生产菌株，再进行紫外诱变筛选获得[5]；酪蛋白：购于广州乔宣化工有限公司；酪氨酸：购于浙江绿州生物技术有限公司；福林酚试剂：购于广州翔博生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

ZHJH-2112B生物洁净工作台、V63旋涡振荡器、LRH-250生化培养箱、721型分光光度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制备

1.3.1.1 种曲培养基

种曲培养基的配制：麸皮∶豆粉∶面粉为80∶15∶5，自来水100 mL，pH自然，润水20 min，于121 ℃湿热灭菌30 min。

1.3.1.2 成曲培养基

大豆∶面粉为90∶10，pH自然。大豆的处理方法：大豆挑选后，在40 ℃温水中浸泡3 h，沥干，然后于121 ℃湿热灭菌30 min；面粉的处理方法：将面粉焙炒至金黄色，不能焦糊；制备成曲培养基：将大豆在不锈钢盆里摊冷，待热气接近消失时，均匀拌入焙炒好的面粉即可[6]。

1.3.2 制曲工艺流程

制曲工艺流程见图1。

图1 制曲工艺流程Fig.1 Process flow of soy sauce koji making

1.4 理化指标的测定方法

蛋白酶活力的测定：福林法[7]；糖化酶活力的测定：斐林法[8]。

2 结果与分析

2.1 制曲优化试验

2.1.1 试验设计与结果

本试验采用L9(34)设计，不考虑因素间的交互作用，留一项空白列作为误差项，分别在3 h，30 min和36 h两边选取其他水平，每个水平做3个重复，主要以蛋白酶活力作为评价标准，辅以糖化酶活力来进行综合评判，分析不同因素对制曲的影响程度，确定制曲的优势工艺组合。

表1 试验方案及其结果Table 1 Scheme and results of experiment

2.1.2 正交试验的直观分析

表2 蛋白酶活力的直观分析表Table 2 Visual analysis of protease activity

表3 糖化酶活力的直观分析表Table 3 Visual analysis of glucoamylase activity

由直观分析表2和表3中的极差大小顺序可知，影响成曲中蛋白酶活力的因素主次为A>B>C，最佳方案为A2B2C3，即浸豆时间3 h,蒸料时间30 min，制曲时间40 h；影响成曲中糖化酶活力的因素主次为B>A>C，最佳方案为A2B2C2，即浸豆时间3 h,蒸料时间30 min，制曲时间36 h。这2种酶活力的最佳方案不同的原因是由于蛋白酶和糖化酶在当前环境条件下的生成速率和稳定性不同。

图2 酶活力直观趋势图Fig.2 Trend chart of protease activity and glucoamylase activity

由图2可知，蛋白酶活力和糖化酶活力在浸豆时间3 h和蒸煮时间30 min时产酶活力较高，其中浸豆时间的趋势图拐点说明浸豆3 h对产酶最有利，蒸煮时间在20～30 min内对酶活的影响趋势比较平缓，说明此时间段内的大豆蛋白变性速度减缓，30 min后明显呈下降趋势，说明30 min后大豆蛋白很快就过度变性了；而随制曲时间的延长，酶活力变化趋势相对较平稳。2种酶的趋势图有所不同，特别是制曲时间的趋势图，可以初步判断2种酶达到最大酶活力的时间不同。由蛋白酶活力和糖化酶活力的分析结果可知，其各自对酶活力的影响程度与直观分析中极差大小顺序是一致的，为了制得高蛋白酶活力和酶系丰富的成曲，在不考虑交互作用的情况下，综合上述结果，确定最优方案为A2B2C3，即浸豆时间3 h，蒸煮时间30 min，制曲时间40 h。但由于制曲时间对2种酶活力的影响不显著，且正交结果分析发现2种酶活力不在同一时间达到峰值，在36～42 h之间的变化趋势还不明朗，有必要通过验证试验来确定最终优方案。

2.2 优化方案验证试验

依据正交试验结果，选取制曲时间36，37，38，39，40，41，42 h，在浸豆时间3 h和蒸煮时间30 min的条件下制曲，测定蛋白酶和糖化酶活力在此时间段内的酶活力变化情况，确定最终优方案。

图3 酶活力随制曲时间的变化趋势Fig.3 Trend of enzymatic activity with changes of koji-making time

由图3可知，糖化酶活力在38 h时达到峰值936.73 U/g干曲，与正交试验确定的最优方案推迟了2 h，从其直观分析表中可以看到，制曲时间中的k2和k3相差很小，在36～40 h内可能出现其最大酶活力峰值；而蛋白酶活力在40 h时达到峰值1435.52 U/g干曲，与正交试验的结果吻合。由糖化酶活力的变化趋势可以看到，糖化酶活力在此时间段内还是比较稳定的，而且蛋白酶和糖化酶活力都高于其他试验值，因此在“以蛋白酶为主，兼顾糖化酶”的原则下，可以确定制曲条件的最优方案为A2B2C3，即浸豆时间3 h，蒸煮时间30 min，制曲时间40 h。

3 结论

酱油制曲影响蛋白酶活力的因素主次顺序为浸豆时间>蒸煮时间>制曲时间，其中浸豆时间和蒸煮时间对蛋白酶活力有显著影响，较优水平为浸豆时间3 h、蒸煮时间30 min、制曲时间40 h；同时也得出了糖化酶活力的因素主次顺序为蒸煮时间>浸豆时间>制曲时间，其中蒸煮时间和浸豆时间对糖化酶活力有显著影响，较优水平为浸豆时间3 h、蒸煮时间30 min、制曲时间36 h。在正交试验的基础上，较优方案的验证试验结果表明,在浸豆时间3 h和蒸煮时间30 min的条件下，蛋白酶活力在40 h时达到了最大值1435.52 U/g干曲，糖化酶活力在38 h时达到了最大值936.73 U/g干曲。因此，在“以蛋白酶为主，兼顾糖化酶”的原则下，最终确定制曲的最佳工艺条件为浸豆时间3 h，蒸煮时间30 min，制曲时间40 h。