两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究

卢慧茵，王炜，崔春

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510641)

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)属于水解酶类，可催化L-谷氨酰胺水解生成L-谷氨酸和氨[1]。在食品工业特别是酱油酿造工业中，谷氨酰胺酶具有重要的应用价值。在酱油的酿造过程中，向酱油曲料中添加一定量的谷氨酰胺酶，利用其水解活力，将体系中的谷氨酰胺转化为谷氨酸，有助于提高酱油鲜味，从而得到品质更高的酱油[2]。此外，谷氨酰胺酶还被应用于米谷蛋白的脱酰胺，脱酰胺后的米谷蛋白各种功能特性如起泡性、溶解性等都有了明显的改善[3]。

谷氨酰胺酶广泛分布于细菌、酵母、真菌等微生物中以及哺乳动物等真核生物中。目前已有报道多种微生物能产谷氨酰胺酶，如Bacilluscirculans[4]，Pseusomonasaeruginosa[5]，Trichodemakoningii[6]等细菌菌株，Pichia[7]，Debaryomycesspp.[8]等酵母菌株，Tilachlidiumhumicola[9]，Verticilliummalthousei[10]等真菌菌株。有研究证明，硝基还原假单胞菌、米曲霉等菌株来源的谷氨酰胺酶除具有水解活性外，还具有转肽酶活力，它能催化γ-谷氨酰单体水解，转移并形成γ-谷氨酰肽[11,12]，如以谷氨酰胺、乙胺为底物，在谷氨酰胺酶的催化下合成茶氨酸[13]。

尽管目前对不同菌株来源的谷氨酰胺酶的水解酶特性已有系统性深入研究，但同一微生物菌株来源不同企业生产的谷氨酰胺酶的酶学特性如pH、温度、盐含量等仍有较大差异。本文选取了2种解淀粉芽孢杆菌来源的谷氨酰胺酶，对比分析不同因素对其水解活力和转肽酶活力的影响，旨在为谷氨酰胺酶在食品工业中更好的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

磷酸、硼酸：江苏强盛功能化学股份有限公司；冰乙酸、氯化钠、一水合柠檬酸：上海润捷化学试剂有限公司；三氯乙酸：上海凌峰化学试剂有限公司；硫酸：北京化学试剂厂；无水氯化锂：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市福晨化学试剂厂；十二水磷酸氢二钠：广州市金华大化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

双甘肽：麦克林试剂；铵离子标准溶液：上海般特有限公司；谷氨酰胺：购于湖北华阳医药有限公司；谷氨酰胺酶：市售。

溶液配制：0.2 mol/L NaOH溶液，Britton-Ronbinson缓冲液A，0.05 mol/L 磷酸、硼酸、醋酸混合酸溶液，根据所需pH值的缓冲液，用0.2 mol/L NaOH溶液进行调节，得到pH为2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，12.0的系列缓冲液；10%三氯乙酸溶液；20%氯化锂溶液(20 g无水氯化锂溶于pH 2.0的硫酸溶液中)；pH 3.0和pH 7.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。

携带型水质测量仪(321-NH4)、铵离子选择电极 上海般特股份有限公司；数显恒温水浴锅(HH-4) 江阴市保利科研器械有限公司；pH计(雷磁PHS-3E) 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探究不同pH对谷氨酰胺酶水解活性的影响

酶活的测定方法参考崔春等[14]的方法，略加修改。取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL不同pH的系列Britton-Ronbinson缓冲液中，加入0.01 g反应底物谷氨酰胺，于37 ℃精确保温10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CH。

1.2.2 探究谷氨酰胺酶在不同pH中的稳定性

酶活的测定方法参考崔春等的方法，略加修改。取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL不同pH的系列Britton-Ronbinson缓冲液中保温16 h。取1 mL 经处理的酶溶液，加入2 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson缓冲液，0.01 g反应底物谷氨酰胺，于37 ℃精确保温10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CH。

1.2.3 探究不同温度对谷氨酰胺酶水解活性的影响

取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson缓冲液中，加入0.01 g反应底物谷氨酰胺，于30，35，40，45，50 ℃精确保温10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CH。

1.2.4 探究谷氨酰胺酶在不同温度中的稳定性

取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson缓冲液中，于30，35，40，45，50 ℃精确保温1 h。加入0.01 g反应底物谷氨酰胺，于37 ℃精确保温10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CH。

1.2.5 探究不同盐含量对谷氨酰胺酶水解活性的影响

准确称取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g氯化钠，用pH 9.0 Britton-Ronbinson缓冲液定容至10 mL，得到盐含量分别为5%，10%，15%，20%，25%的缓冲液。取谷氨酰胺酶0.01 g，加入3 mL上述缓冲液中，加入0.01 g反应底物谷氨酰胺，于37 ℃精确保温10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CH。

1.2.6 探究不同因素对谷氨酰胺酶转肽活性的影响

探究pH对谷氨酰胺酶及其稳定性的影响，温度对谷氨酰胺酶及其稳定性的影响，盐含量对谷氨酰胺酶的影响，上述变量的控制分别参考1.2.1，1.2.2，1.2.3，1.2.4，1.2.5。取谷氨酰胺酶0.01 g，加入3 mL上述缓冲液中，加入反应底物谷氨酰胺和双甘氨肽各0.01 g，于37 ℃精确保温10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液终止反应，将反应液以pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化锂溶液，用铵离子选择电极进行铵离子含量测定，记为CT，则δC=CT-CH即可表征谷氨酰胺酶的转肽活性。

1.2.7 数据分析

实验结果为3组平行样品的平均值，表示为“平均值±标准偏差”，使用Excel 2016软件进行数据分析，使用SPSS 2.0对统计数据进行配对样本T检验分析。

2 结果与分析

2.1 pH对谷氨酰胺酶催化活性及其稳定性的影响

图1 pH对谷氨酰胺酶水解和转肽相对酶活的影响Fig.1 The effect of different pH values on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由图1可知，谷氨酰胺酶催化水解反应和转肽反应的最适pH不相同。对于厂家一谷氨酰胺酶来说，水解反应的最适pH为7.0，在pH范围为7.0～9.0之间均保持较高的水解活性，当pH大于12.0时，水解活性急剧下降直至失活，这和Alexandra W Z等[15]对鼠李糖乳杆菌生产的谷氨酰胺酶的研究结果一致；而转肽反应的最适pH为10.0，在碱性条件下能保持较高的转肽活性，但当pH高于12.0时，转肽活性也表现出大幅度的下降。对于厂家二谷氨酰胺酶来说，水解反应的最适pH为7.0，当pH高于7.0时，水解活性开始下降；转肽反应的最适pH为9.0。谷氨酰胺酶的蛋白质三级结构是其功能的基础，pH的变化会使维持蛋白质空间构象的作用力发生变化，影响其结构，从而影响其催化的反应类型[16]。

图2 pH与谷氨酰胺酶稳定性的关系Fig.2 The relationship between pH and stability of glutaminase

由图2可知，2种谷氨酰胺酶在较大的pH范围内(6.0～10.0)均能保持一定的活性，这比Pichaguilliermondii所产谷氨酰胺酶的pH稳定范围更广泛，该酵母所产谷氨酰胺酶在酸性条件下较稳定，当pH高于4.5时，酶活开始快速下降，这可能是因为谷氨酰胺酶的产酶微生物均是解淀粉芽孢杆菌。

2.2 温度对谷氨酰胺酶催化活性及其稳定性的影响

图3 温度对谷氨酰胺酶水解和转肽相对酶活的影响Fig.3 The effect of different temperatures on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由图3可知，温度对2种谷氨酰胺酶反应的影响是一致，随着温度的升高，相对酶活逐渐升高，在最适温度下相对酶活达到最高，随后急剧下降。对于厂家一谷氨酰胺酶而言，水解反应和转肽反应的最适温度为50 ℃，这和Moriguchi等[17]从藤黄微球菌中分离出来的2种谷氨酰胺酶以及康维民等[18]从枯草杆菌中分离的谷氨酰胺酶的最佳反应温度一致，但和Klein等[19]从芽孢杆菌中分离的谷氨酰胺酶的最适反应温度(37 ℃)不相同，其原因可能是实验过程中的保温时间不一致。由图3也可知，温度对厂家二谷氨酰胺酶的活性影响更明显，该谷氨酰胺酶的最适温度为45 ℃，当温度从30 ℃升高到45 ℃时，相对水解酶活从43.54%升高到100%，转肽相对酶活更是从9.44%升高到100%，当温度超过45 ℃时，相对酶活则急剧下降。

图4 谷氨酰胺酶稳定性与温度的关系Fig.4 The relationship between temperature andstability of glutaminase

由图4可知，在不同的温度下，厂家一谷氨酰胺酶的水解和转肽酶活力均比厂家二谷氨酰胺酶高。就酶的稳定性而言，在不同温度下保温1 h后，厂家一谷氨酰胺酶在30～50 ℃之间都能保持较高的酶活，即使在50 ℃也能保持58.39%的相对酶活，Aryuman等测得的谷氨酰胺酶的温度稳定范围较低(25～37 ℃)，实验中厂家二谷氨酰胺酶的温度稳定范围较窄(30～40 ℃)，这可能都与产酶的菌种不同有关。

2.3 盐含量对谷氨酰胺酶催化活性的影响

图5 盐含量对谷氨酰胺酶水解和转肽相对酶活的影响Fig.5 The effect of concentration of NaCl on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由图5可知，对于水解活性而言，谷氨酰胺酶具有一定的耐盐性，厂家一谷氨酰胺酶在盐含量达到15%时仍能保持78.41%的相对酶活，厂家二谷氨酰胺酶也能保持72.73%的相对酶活，这与谷氨酰胺酶的结构有关，Yoshimune等研究表明谷氨酰胺酶片段C端领域是1个含有81个氨基酸的片段，当盐浓度超过1.7 mol/L时，该片段会发生构型变化，从而使谷氨酰胺酶具有一定的耐盐性[20,21]。但对于转肽活性而言，随着盐含量增加，其活性不断下降，表明谷氨酰胺酶在低盐条件下才能表现出较好的转肽活力。

3 结论

谷氨酰胺酶因具有催化水解和转肽2种功能越来越受到关注。本文的结果表明厂家一谷氨酰胺酶催化水解反应的最适pH为7.0，最适温度为50 ℃，催化转肽反应的最适pH为10.0，最适温度为50 ℃，在较宽的pH(6.0～10.0)和温度范围(30～50 ℃)内均能保持较高的酶活；厂家二谷氨酰胺酶催化水解反应的最适pH为7.0，最适温度为45 ℃，催化转肽反应的最适pH为9.0，最适温度为45 ℃，在pH 6.0～10.0 和温度30～40 ℃范围内可保持一定的酶活。结果还表明谷氨酰胺酶表现水解活性时具有一定的耐盐性，但表现转肽活性时，酶活会随着反应体系中盐含量的增加而下降。对比2种谷氨酰胺酶可以发现，不论是水解活性还是转肽活性，在不同的pH、温度或是盐含量下，厂家一谷氨酰胺酶的酶活力总是高于厂家二谷氨酰胺酶的酶活力，并且后者的稳定性较差，由此可见，厂家一谷氨酰胺酶更适合于工业生产。本文从pH、温度、盐含量3个因素出发，探究了其对谷氨酰胺酶水解活性和转肽活性的影响，旨在为谷氨酰胺酶的实际应用提供一些理论指导。