发酵大蒜加工过程中功能物质与抗氧化活性的变化研究

唐仕荣，陈尚龙，苗敬芝，高菲，孙苗

(1.徐州工程学院 食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

大蒜是一种古老的药食两用植物，具有健脾、抗菌、提高免疫力、降血压、抗肿瘤等作用。但常常由于其刺激性和蒜臭味导致无法得到消费者的广泛认可。新鲜大蒜在高温高湿条件下自然发酵而成的发酵大蒜，又称黑蒜，无新鲜大蒜的蒜臭味及刺激性气味，入口香甜，成为了国内外研究的热点。大蒜发酵过程中，自身组织破坏后，发生一系列的酶促反应和非酶褐变反应，主要包括美拉德反应、焦糖化反应等，美拉德反应的最终产物——类黑素是黑色的主要来源[1]。据报道，发酵大蒜在保留大蒜原有主要功能成分的基础上，蛋白质、氨基酸等营养成分更加丰富，多酚类物质含量提高5倍以上，抗氧化能力明显增强，生理活性更加突出[2]；发酵过程中蛋白质大量转化成为人体必需的氨基酸，对增强免疫力、消除疲劳、促进生长代谢具有重要的作用，对糖尿病、高血压、高血脂以及癌症等有明显的预防和治疗作用[3]。发酵大蒜研发以来，在日本、韩国、新加坡等地迅速风靡，成为大众推崇的保健食品之一。

传统黑蒜发酵工艺较为简单，新鲜大蒜在高温高湿条件下自然发酵60～90天，直到蒜瓣都变成黑色，发酵周期较长，生产成本较高。随着工艺的优化，对大蒜进行预处理和提高发酵温度能明显缩短发酵时间[4]，对大蒜进行冷冻处理、高温短时加热、超声预处理等能提高大蒜发酵过程中还原糖、总酚等物质的含量，但预处理工艺较为繁琐。这些工艺优化的重点在于发酵温度、湿度和时间等工艺参数的确定，对大蒜发酵过程中营养成分的变化研究不多，没有深入研究大蒜发酵过程中各种成分的变化规律，特别是营养物质、功能成分以及功能活性之间的关系。为深入研究大蒜的发酵规律，本试验在前期研究的基础上，采用恒温恒湿发酵法，重点考察大蒜发酵过程中总糖与还原糖、蛋白质与氨基酸等营养成分以及总多酚与大蒜素等抗氧化物质随时间的变化关系，探讨不同条件下发酵大蒜营养成分与抗氧化活性间的变化关系，对优化发酵工艺，促进功能物质生成，保证黑蒜品质与功能活性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜：采购于徐州七里沟农贸市场；大蒜素(标准品)：上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂、考马斯亮蓝、乙醇等：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；ZH-TH-80恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 发酵大蒜的制备

采用恒温恒湿发酵，在温度70 ℃、湿度80%条件下发酵，每5天取出适量大蒜进行还原糖、氨基酸、多酚等物质含量及抗氧化活性分析。

1.4 检测方法

1.4.1 大蒜多糖和还原糖的测定

适量大蒜经纯水提取，采用苯酚-硫酸法测定多糖[5]，3,5-二硝基水杨酸显色法测定还原糖[6]，根据提取液体积计算多糖和还原糖提取率。

1.4.2 蛋白质和氨基酸的测定

适量大蒜经纯水提取多糖，粗蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[7]，游离氨基酸采用茚三酮显色法测定[8]，根据提取液体积计算提取率。

1.4.3 总多酚含量的测定

以没食子酸为标准物质，采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚[9]。根据提取液体积计算提取率。

1.4.4 大蒜素的高效液相色谱分析

样品提取：2 g左右的大蒜加100 mL 70%乙醇，破碎，搅拌10 min，超声波超声提取30 min，4000 r/min离心10 min，上清液抽滤，测量提取液体积，待测。

色谱条件：色谱柱Diamonsil Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：V甲醇∶V水为80∶20；柱温25 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。

以大蒜素为标准物质，配制不同浓度标准样品进样分析，绘制标准曲线，由标准曲线定量分析供试溶液中大蒜素的浓度，根据提取液体积计算大蒜素提取率。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

利用DPPH自由基的无水乙醇溶液呈紫色，在517 nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。加入抗氧化剂时使DPPH自由基数量减少，溶液颜色变浅，分光光度法测定吸光度变化，计算其抗氧化能力。具体测定方法参见文献[10]。

1.5.2 超氧自由基清除能力的测定

在弱碱性条件下，邻苯三酚能发生自氧化反应，生成超氧阴离子自由基和有色中间产物，该中间产物在320 nm波长处有特征吸收峰。加入清除剂时能迅速与超氧自由基反应，从而阻止中间产物的积累，致使溶液吸收减弱。具体测定方法参见文献[11]。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中总糖和还原糖含量的变化

还原糖和总糖含量的高低直接影响最终产品的口感和变黑速率。发酵过程中每5天取样测定蒜样中还原糖和总糖含量，结果见图1。

图1 黑蒜发酵过程中总糖和还原糖含量的变化

由图1可知，大蒜发酵过程中，总糖和还原糖含量均呈先逐渐上升，达到最大值之后缓慢下降的趋势。这可能是由于在发酵过程中，大蒜中的淀粉等在淀粉酶作用下，被分解成多糖类物质，总糖含量逐渐上升，20天时达到最大；之后由于美拉德反应加快，多糖被消耗的速率大于生成速率，导致含量逐渐降低。研究表明还原糖是美拉德反应的主要物质。大蒜发酵初期还原糖含量增长缓慢，之后迅速增加，25天时达到最大值3.768 mg/g。这可能是由于发酵初期多糖含量较低，分解速率较慢，随着多糖含量的增加和美拉德反应的加快，还原糖的积累逐渐增大；美拉德反应最终生成棕色甚至黑色的类黑素物质，还原糖作为大蒜黑化反应的前体物质也将随着发酵的进行而逐渐被消耗，导致黑蒜甜味减弱[12]。因此，为提高黑蒜品质，初期可以适当提高发酵温度以加快还原糖的生成速率，后期适当降低发酵温度以减缓还原糖的转化消耗速率，从而有利于还原糖的积累和黑蒜良好口感的形成。

2.2 发酵过程中氨基酸和蛋白质含量的变化

氨基酸是人体合成蛋白质的重要原料，补充适量氨基酸对人体有着重要的作用。氨基酸含量高低直接影响发酵大蒜的品质，氨基酸大多来源于蛋白质的分解，大蒜发酵过程中蛋白质和氨基酸的含量变化见图2。

图2 黑蒜发酵过程中蛋白质和氨基酸含量的变化

由图2可知，发酵过程中，大蒜中氨基酸的含量先快速增长，25天时达到最大值2.012 mg/g，之后缓慢下降。大蒜中氨基酸量的增加主要来源于蛋白质的分解。在发酵初期，美拉德反应速率较慢，美拉德反应消耗氨基酸的速率远低于蛋白质分解生成氨基酸的速率，因此氨基酸含量逐渐增加；随着发酵时间的增加，美拉德反应速率加快，氨基酸的消耗速率大大增加，导致氨基酸的含量逐渐降低。对大蒜中蛋白质而言，其含量逐渐增大，30天之后增长变缓，这可能是由于大蒜中其他含氮物质转化为蛋白质的同时存在部分蛋白质分解为氨基酸导致蛋白质含量有所降低[13]。但发酵大蒜中氨基酸和蛋白质的含量均高于新鲜大蒜，极大地提高了黑蒜的营养价值。

2.3 发酵过程中总多酚含量的变化

多酚是发酵大蒜中重要的功能性成分，其含量高低影响着大蒜的抗氧化功效。大蒜发酵过程中总多酚含量的变化见图3。

图3 黑蒜发酵过程中总多酚含量的变化

由图3可知，发酵过程中，大蒜总多酚含量先缓慢增长，之后迅速增大到最大值，比新鲜大蒜中多酚含量高4.15倍。研究表明：大蒜发酵过程中大分子物质分解生成小分子物质，能释放出更多的酚羟基，使其多酚含量得到提高，主要为没食子酸类化合物，具有良好的抗氧化能力[14]。发酵后期，多酚类物质可能发生缩合反应，生成褐色物质，导致总多酚含量出现下降趋势。

2.4 发酵过程中大蒜素含量的变化

大蒜素是新鲜大蒜风味的主要标志物质，但大蒜素不稳定，在受热、光照等作用下容易发生降解。大蒜发酵过程中大蒜素含量的变化见图4。

图4 黑蒜发酵过程中大蒜素含量的变化

由图4可知，发酵初期，大蒜素含量随着大蒜的发酵迅速降低，10天后缓慢下降，发酵40天的黑蒜中大蒜素含量仅为新鲜大蒜的11%左右，几乎没有新鲜大蒜的刺激性气味。研究认为，经过长时间的发酵与熟化，不稳定的大蒜素可能转化为其他抗氧化能力更强的含硫化合物[15]，使得发酵大蒜的体外抗氧化能力明显高于新鲜大蒜。

2.5 发酵过程中抗氧化活性的变化

将大蒜提取液适当稀释，分别移取不同浓度样品做DPPH自由基和超氧自由基清除试验，分析样品浓度与抗氧化能力之间的关系。一般采用清除率50%时的浓度即IC50值来衡量样品的自由基清除能力，IC50值越小，其清除自由基的能力越强，抗氧化能力也越强。发酵过程中大蒜 IC50值的变化见图5。

图5 黑蒜发酵过程中抗氧化活性的变化

由图5可知，发酵大蒜提取液对DPPH自由基和超氧自由基清除能力的IC50值随着发酵时间的延长刚开始迅速降低，而后缓慢减小，30天后IC50值下降非常缓慢，表明随着发酵的进行，大蒜对DPPH自由基和超氧自由基的清除能力不断增强，30天之后黑蒜的抗氧化能力几乎达到最大，继续发酵，抗氧化能力提高非常有限。发酵40天的黑蒜提取液对DPPH自由基和超氧自由基清除能力的IC50值分别为0.857，0.764 mg/mL，抗氧化能力是新鲜大蒜的11.25倍和9.22倍。实验发现，黑蒜提取液对DPPH自由基和超氧自由基清除效果与样品浓度之间呈较明显的量效关系，样品浓度越大，清除率越高；发酵15天之后，黑蒜提取液浓度最大时对DPPH自由基和超氧自由基的清除率均大于90%，表明黑蒜具有良好的抗氧化能力。研究认为，大蒜发酵过程中美拉德反应产生的氨基酸、糖类、多酚以及含硫化合物等量的增加是抗氧化能力显著提高的根本原因[16]。

2.6 发酵过程中营养物质含量与抗氧化活性间的相关性分析

采用SPSS 23.0计算大蒜发酵过程中各物质含量与抗氧化活性间的相关性，见表1。

表1 黑蒜发酵过程中物质含量与抗氧化活性间的相关性分析

注：“*”表示显著相关，P<0.05；“**”表示极显著相关，P<0.01。

由表1可知，超氧自由基清除能力的IC50值与DPPH自由基清除能力的IC50值呈极显著正相关(r=0.976，P<0.01)，大蒜素的含量与DPPH自由基清除能力的IC50值呈极显著正相关(r=0.992，P<0.01)，而总糖、还原糖、氨基酸、蛋白质、总多酚等物质含量与DPPH自由基清除能力的IC50值呈负相关。由于IC50值与自由基清除能力呈负相关关系，则总糖、还原糖、氨基酸、蛋白质、总多酚等物质含量与DPPH自由基清除能力呈正相关，其中蛋白质、氨基酸、还原糖等物质含量与DPPH自由基清除能力呈极显著正相关(P<0.01)，与多酚含量呈显著正相关(P<0.05)，表明蛋白质、氨基酸、还原糖、多酚是发酵大蒜中最主要的抗氧化成分，为提高发酵大蒜的抗氧化能力，应优化发酵参数，综合考虑，尽可能提高这些成分的含量。

3 结论

恒温恒湿条件下发酵大蒜，重点考察了发酵过程中总糖和还原糖、蛋白质与氨基酸、多酚与大蒜素等物质随时间的变化规律。结果表明：大蒜外观颜色随发酵时间的延长逐渐变黑，新鲜大蒜特有的刺激性气味和辛辣味逐渐减弱，到最后几乎没有。总糖和还原糖含量均先上升后缓慢下降，碳水化合物的积累使得发酵大蒜具有一定的甜度，增强了口感。大蒜发酵过程中其他含氮化合物转化蛋白质的同时，蛋白质大量分解产生了包含人体必需的游离氨基酸，使得发酵大蒜中氨基酸和蛋白质的含量明显高于新鲜大蒜，大大提高了大蒜的营养价值。总酚含量的显著增加赋予了发酵大蒜更强的抗氧化性。相关性分析表明：蛋白质、氨基酸、还原糖和总酚含量与发酵大蒜抗氧化能力呈显著正相关，是发酵大蒜中最主要的抗氧化物质。因此，发酵大蒜是一种具有良好抗氧化功能的营养保健食品，发酵过程是一系列物理化学反应共同作用的结果，应根据各物质含量的变化规律合理控制发酵温度、湿度和时间，进一步优化大蒜发酵工艺参数，以达到最佳的产品外观、口感、营养成分和功能活性。