不同年限及不同干燥方法的辽细辛中主要成分的含量测定△

2018-10-17张晓婉黄健宋冬梅董育瑄王晶路金才贾凌云

中国现代中药 2018年9期

张晓婉，黄健，宋冬梅，董育瑄，王晶，路金才，贾凌云*

(1.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳 110016；2.辽宁和悦医药科技有限公司，辽宁沈阳 110180)

辽细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛的干燥根及根茎，主产于辽宁的抚顺、丹东、吉林长白山以及黑龙江等地。细辛具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮等功效[1]。现代市场上常见的细辛干燥方法一般都阴干，该方法干燥时间长，不仅影响中药草质量和经济价值同时也直接影响产品的使用和外观[2]。而细辛的主要化学成分包括甲基丁香酚、细辛脂素、黄樟醚、榄香素等挥发性成分以及木脂素类的细辛脂素和痕量的马兜铃酸[3-4]。其中马兜铃酸A在长期服用后可引起肝脏和肾脏的损坏与衰竭[5]，因此马兜铃酸的含量对于细辛药材的安全性起到了关键的作用。因此，本文通过检测甲基丁香酚、细辛脂素以及马兜铃酸三种成分为指标，对不同年限以及不同干燥方法进行分析比较，为完善细辛采收和后续加工方法提供科学依据[6]，3种成分的化学结构式见图1。

图1 马兜铃酸(a)、细辛脂素(b)、甲基丁香酚(c)结构式

1 仪器与材料

Waters 2707-2489-1525分析液相，WD900B型微波炉(输出功率900W，额定微波功率2450 MHz，顺德格兰仕电器厂有限公司)，WS70-1型红外线快速干燥器(功率500 W，电压220 V，上海锦屏仪器仪表有限公司)，SCIENTZ-10ND冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BS124S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ5200E型数控超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，高速多功能粉碎机(28000 r·min-1，上海缘沃工贸有限公司)，XMTH数显控温仪(浙江余姚市远东数控仪器厂)，RE52CS旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

马兜铃酸A、细辛脂素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，HPLC质量分数均大于98%，批号分别为wkq15122902、wkq16071301)，甲基丁香酚对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号为111642-200301)，甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)。

野生辽细辛新鲜药材于2017年9月，采自辽宁省抚顺市北四平乡，由沈阳药科大学中药学院贾凌云副教授鉴定为辽细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.。

2 方法与结果

2.1 细辛的干燥品制备

测定所用的干燥品均用六年生辽细辛鲜品30 g进行干燥，以连续两次干燥后称重的差异小于5 mg为指标判断干燥是否完全。不同干燥方法处理后的干燥品的质量约为14 g，最后确定的干燥时间为：阴干12 d、50 ℃烘干6 h、70 ℃烘干1.5 h、微波干燥4 min、红外干燥1 h、冻干1 h。

2.2 HPLC法测定马兜铃酸、细辛脂素和甲基丁香酚的含量

2.2.1 马兜铃酸、细辛脂素和甲基丁香酚的色谱条件和系统适用性色谱柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)为72：28等度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：316 nm；进样量：10 μL；柱温30 ℃。在此色谱条件下，理论塔板数以马兜铃酸A计算不得低于5000，相邻色谱峰的分离度应大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，色谱图见图2。

图2 马兜铃酸对照品溶液色谱图

色谱柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脱程序：0～10 min，ö(A)55%～60%；10～15 min，φ(A)60%～65%；15～30 min，φ(A)65%～71%；30～35 min，φ(A)71%～55%；流速：1.0 mL· min-1；检测波长：285 nm；进样量：5 μL；柱温30 ℃。在此色谱条件下，理论塔板数以细辛脂素计算不低于10 000，相邻两峰的分离度应大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，色谱图见图3。

图3 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照储备液取马兜铃酸A 10.16 mg，置25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，再吸取1 mL置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，获得浓度为40.64 mg·L-1的马兜铃酸A对照储备液。另取甲基丁香酚10.53 mg，细辛脂素14.46 mg分置10 mL容量瓶，再分别取1 mL和0.5 mL的储备液于10 mL的容量瓶中，分别获得浓度为105.3 mg·L-1和72.3 mg·L-1作为细辛脂素和甲基丁香酚的混和对照储备液。

2.2.2.2 供试溶液取不同年限及不同干燥方法的辽细辛药材粉末各1 g，置25 mL锥形瓶中，超声提取3次，每次加5 mL分析甲醇。过滤后合并提取液，甲醇溶解并定量转移至10 mL容量瓶中，过滤(0.22 μm)，取续滤液即为马兜铃酸的供试溶液。再取不同年限及不同干燥方法的辽细辛药材粉末各0.5 g，置100 mL锥形瓶中，加入20 mL甲醇，称重。水浴回流1小时，取出，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，过滤(0.22 μm)，取续滤液即为细辛脂素和甲基丁香酚的混合供试溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系的考察精密吸取马兜铃酸A对照储备液0.5、1.5、2.5、3.5、5.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各吸取10 μL进行液相分析，再精密吸取“2.3.2.1”项下的对照品溶液1、2、4、8、10 mL细辛脂素和甲基丁香酚的混和对照储备液，按照上述方法获得系列标准溶液后，各吸取5 μL进行液相分析。以对照储备液峰面积(A)为纵坐标，以溶液的质量浓度(ρ，mg·L-1)横坐标，绘制标准曲线，得到马兜铃酸A的回归方程为：A=1.433 5×104ρ+1.06×103，r=0.999 2；甲基丁香酚的回归方程为：A=7×108ρ+4.431 62×105，r=0.999 2；细辛脂素的回归方程为：A=2×109ρ+5.218 68×105，r=0.999 3结果表明，马兜铃酸A、甲基丁香酚以及细辛脂素的质量浓度分别在2.032～22.352 mg·L-1、10.53～105.3 mg·L-1及7.23～723 mg·L-1的浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验精密吸取马兜铃酸对照储备液10 μL及混合对照储备液5 μL，在“2.2.1”条色谱条件下连续进样6次，其马兜铃酸的RSD值为1.54%，细辛脂素和甲基丁香酚的RSD值分别为1.74%、1.55%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验取六年生阴干的辽细辛药材约1 g，按照“2.2.2.2”条方法平行制的6份供试溶液，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，测得马兜铃酸A含量的RSD值为0.94%，另取六年生阴干的辽细辛药材约0.5 g，同理测得其细辛脂素和甲基丁香酚的含量的RSD值分别为1.82%、1.14%，表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验取马兜铃酸供试溶液分别于0、2、4、6、8、12 h吸取10 μL注入液相色谱仪，按照“2.2.1”条色谱条件测定峰面积，测得马兜铃酸A峰面积的RSD值为1.14%，同理取细辛脂素和甲基丁香酚混合供试溶液以相同的时间点各吸取5 μL注入液相色谱仪，测得其细辛脂素和甲基丁香酚峰面积的RSD值分别为1.08% 、0.69%，表明供试品溶液在室温下稳定性良好。

2.2.7 加样回收率称取已知含量的辽细辛药材粉末6份，每份约1 g，精密称定。按照“2.2.2.2”条方法制备供试溶液，并精密加入马兜铃酸对照储备液适量，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，计算马兜铃酸回收率，结果见表1。

表1 马兜铃酸A的加样回收率的结果

再称取已知含量的细辛药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定。按照同样方法制备供试溶液，并精密加入混合对照储备液适量，按照“2.2.1”条色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表2。

2.2.8 样品含量测定取不同年限和不同干燥方法的辽细辛药材三份，按照“2.2.2.2”条方法制备供试溶液，在“2.2.2.1”的条件下，分别精密吸取不同年限和不同干燥的供试品溶液各10 μL进入液相，以外标一点法计算供试品中马兜铃酸的含量，并计算其他干燥品相对于六年生阴干中马兜铃酸的含量变化率，结果见图3和图4。