基于电子舌技术对不同来源龙胆的苦味与品质相关性研究△

赵童瑶，尹海波，李旭，陶玲，杨婷婷，刘洪娇

(辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600)

龙胆作为常用的传统中药，始载于《神农本草经》[1-2]，为龙胆科Gentianaceae植物条叶龙胆GentianamanshuricaKitag.、龙胆GentianascabraBge.、三花龙胆Gentianatriflorapall.或坚龙胆GentianarigescensFranch.的干燥根及根茎[3]。在我国广泛分布，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古，浙江、湖南、江西、福建、江苏、广东、新疆也有分布[4]。并且很多种类都具有重要的药用价值，药用资源开发潜力巨大[5]。其味甚苦，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效，是中医治疗肝胆疾病的常用药之一。龙胆临床使用时有“味越苦，质越优”的说法，龙胆中所含的龙胆苦苷，具有强烈苦味活性，是龙胆中药显苦寒的主要因素[6-7]。因此苦味可作为评价龙胆中药品质的主要指标。并且由于“入口则知味，入腹则知性”[8]，一直以来中药味道主要经由口尝获得，但是由于个人评价的感觉差异和描述的主观性，历代医学典籍对中药味道的描述并不一致[9]。现今，人们仍然靠感官来评价味道，即用人的感觉器官来辨别，获取药物的真实味道。但人为感官描述主观性强，且量化标准、准确度和重复性方面的把握仍有欠缺，而且中草药的成分分析极其困难。对中草药成分进行定性定量分析，如果仅用传统的光谱、色谱技术，将定量化的指标对应到苦度计算，将会是一个耗时而又费力的处理过程。

近年来发展起来的电子舌(electronic tongue，E-tongue)是一种运用味觉指纹分析技术[10](Gustation Fingerprint Analytical Technique，GFAT)模拟人体味觉器官的仿生学仪器[11]，是一种分析、识别液体“味道”的新型检测手段。它是基于味觉传感器和化学信息学处理方法的味觉识别检测技术。它得到的是样品的整体信息，而不是被测样品中某种或某几种成分的定性与定量结果，又被称作“指纹”数据[12-13]。电子舌技术最早广泛用于食品领域检测，但药食同源，中药材也是来源于自然界的动植物和部分矿物[14]。并且与人体感觉器官舌头相比，电子舌具有超强的客观性、良好的重复性、工作不疲劳、快捷的检测速度和数据电子化等特殊优势[15]。故将电子舌应用于对中药味道的评价有良好的可行性[16]。基于此我们收集了不同产地的龙胆药材10份，并利用电子舌技术对龙胆进行苦味与品种及品质有无相关性的分析。

1 材料

1.1 仪器

Aglient 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，F100型粉碎机(上海高致精密仪器有限公司)，电子天平BP211D(0.01 mg)(上海精密科学仪器有限公司)，超纯水制备仪Milli-Q(密理博(中国)有限公司)，电子舌α-Astree II(7枚电极：ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB)(法国Alpha MOS公司)

1.2 药材与试剂

龙胆苦苷对照品；獐牙菜苦苷对照品；獐牙菜苷对照品。龙胆药材饮片10批，产地分别为来源于云南(购买地为石家庄)、四川、黑龙江、吉林、安徽、云南(购买地为安国)、新宾旺清门、吉林通化、本溪桓仁、清原。

2 实验方法

α-ASTREE Ⅱ电子舌系统(法国Alpha MOS公司，见图1)：由第一套传感器阵列(食品饮料专用，7个味觉传感器ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB和1个氯化银参比电极)、16位自动进样器、数据采集系统及Alphasoft V12工作站软件组成。电子舌经活化、校正、诊断通过，确保采集得到的数据可靠、稳定。室温条件下进行测定，每份样品体积为80 mL。电子舌传感器在每个样品中的采集时间为120 s，每秒采集1个数据，提取第120 s时响应值作为测定数值；每测一个样品，都在水中清洗10 s，每份样品重复测定7次，选取响应趋于稳定的最后3次的测定数据用于计算。

图1 龙胆提取物的电子舌测定精密度试验PCA结果(n=3)

2.1 液相分析分析

2.1.1 供试品溶液的制备 药材用粉碎机粉碎，取粉碎的药材粉末0.3 g，过40目筛然后加入甲醇10 mL超声30 min。用普通漏斗过滤，取滤液之后再用微孔滤膜过滤。取液装入EP管中标号。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品、獐牙菜苦苷对照品、獐牙菜苷对照品适量，加甲醇超声溶解定容，摇匀，作为对照品贮备溶液。

2.2 电子舌分析

2.2.1 电子舌粉末制备 取50 g药材加入10倍量的水，浸泡半小时，煎煮30 min(煮沸10 min)，将煎出液倒出，再加入8倍量的水，煎煮30 min(煮沸10 min)，将煎出液倒出，再重复一次，共煎煮3次，合并3次煎煮液。每次煎煮都要加入0.2 g的碳酸钙以防止酶和有机酸影响药材中的活性成分。用小火熬制合并液使其能放入蒸发皿中，之后用40 ℃水浴加热成干粉状称取1.0 g装入EP管中标明产地。

2.2.2 样品浓度的确定 电子舌的测定原理为分别测定并记录7枚电极对样品溶液的响应值，原始数据为电势差。鉴于此原理，电子舌的响应值与样品浓度(基质溶液的离子浓度和强度)正相关，且灵敏度极高。根据电子舌对中药提取物的响应规律，常用的样品测试浓度为0.625～1.000 mg·mL-1，本研究选择最常用的0.125 mg·mL-1作为供试品测试浓度，测定结果表明此样品浓度溶解良好，且滤液放置后无沉淀现象。

2.2.3 精密度试验 取龙胆提取物样品(1号)约50 mg，精密称定(52.68 mg)，以水400 mL溶解，过滤，分取5份(每份80 mL)进行电子舌测试，记录测定结果并计算样品测试的精密度。

2.2.4 样品口感的电子舌测定对10批龙胆提取物供试品溶液，进行电子舌测定，记录测试结果并进行数据分析。

2.2.5 数据处理方法 主成分分析(PCA)是从多个数值变量之间的相互关系入手，利用降维的思想，将多数变量转变为少数几个互不相关的综合变量的分析统计方法。通过尽可能的保留原有信息量来减少信息维数，用繁杂的多维数据建立有优良可视性的2D/3D图表，原始数据中最大量的信息将被投影在PC1轴，其次是PC2，PC3轴。每一个试样将在PCA图上形成一个集合，各试样集合之间的距离常常用来表示它们之间的化学物质或者味觉上的相似度。它具有不需要先验知识，并找到一组新的数轴来最大限度的描述数据间的差异性，以此找寻最有用的信息，给出具有不同风味区域和簇的描述性图表的优点。

2.3 高效液相特征图谱的分析

2.3.1 色谱条件 流动相：乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液洗脱，流速：0.7 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：285 nm；进样量：10 μL。

2.3.2样品的高效液相特征图谱分析 取“2.1.1”项下制备的样品溶液转移至样品瓶内，进样分析，记录分析结果。

3 实验结果

3.1 电子舌分析结果

3.1.1 精密度试验结果 精密度实验结果表明，7枚电极对样品的响应值测定精密度良好，5份样品的精密度实验结果也符合要求(RSD < 2.0%)，测定结果见表1和图2。

图2 龙胆提取物10批样品的电子舌测定PCA分布图(n=3)

3.1.2 供试品测定结果 电子舌7枚电极对10批不同样品的响应值见表2。

3.1.3 样品的PCA测定结果 对7枚电极的测定结果进行PCA分析，10批龙胆提取物样品的口感可以通过2个主成分PC1和PC2来进行表征，分别能代表80.997%和10.37%的电极测定信息。

样品在结果的PCA图上的分布情况见图3。结果显示，第6批样品和第10批样品与其余样品距离较远；第6批样品和第10批样品之间距离最远，第4批样品和第8批样品之间距离最近。

PCA图上样品之间的相互距离见表3，样品之间的相对距离远近可以暗示其成分组成(口感)的差异大小。

3.1.4 电子舌数据聚类分析结果 9个不同产地10个龙胆药材以主要成分分析获得4个公共因子子使用SPSS 20.0 统计软件处理，采用组间联接聚类方法，距离的计算方法为Euclidean distance，进行层次聚类分析，见图3。

表1 龙胆提取物的电子舌测定精密度试验结果

表2 龙胆提取物10批的电子舌测定结果

表3 10批个不同龙胆提取物样品电子舌测定PCA图上相互距离分布表

图3 电子舌数据聚类分析

根据图3结果显示10个样本共分为3 类，其中4号(吉林)，8号(通化)，7号(新宾)，9号(本溪)4个样品聚为第一类；1号(云南，产于石家庄)，5号(安徽)，3号(黑龙江)3个样品聚为第二类；2号(四川)，6号(云南，产于安国)2个样品聚为第三类；10号(清原)单独聚为第四类。

从图3和表2可知，苦度较大的样品聚在了第一类和第四类，由此可以判断以上这两类龙胆药材味道较苦。

3.2 高效液相特征图谱的分析结果

3.2.1 龙胆的高效液相色谱的结果

标准曲线(见图4)

龙胆苦苷：Y=818.75X+111.72r=0.999 7

獐牙菜苦苷：Y=2 026.1X+2.913 2r=0.999 5

獐牙菜苷：Y=2 277.2X-0.599 7r=0.999 7

图4 獐牙菜苷，龙胆苦苷，獐牙菜苦混合标准品HPLC色谱

图5 龙胆样品的HPLC色谱图

3.2.2 不同产地龙胆三种有效成分的含量测定 高效液相色谱法测定出十种样品中有效成分的含量见图5。

3.2.3 高效液相数据聚类分析结果 9个不同产地10个龙胆药材以主成分分析获得的4个公共因子使用SPSS20.0统计软件处理，应用组间联接聚类的方法，Euclidean distance距离的计算方法进行层次聚类结果的分析见图6。

表4 不同产地的龙胆有效成分含量

图6 液相数据聚类分析图

结果显示10个样本共分为4类。其中5号(安徽)、10号(清原)、4号(吉林)、9号(本溪桓仁)4个样品聚为第一类；7号(新宾)、8号(通化)2个样品聚为第二类；2号(四川)、6号(云南，产于安国)2个样品聚为第三类；1号(云南，产于石家庄)、3号(黑龙江)2个样品聚为第四类。

从图6和表4可知，质量较好的样品聚成了第二类，新宾和通化样品均聚在这一类，由此可以得出以上两产地的龙胆药材质量较优且稳定。

3.3 显微鉴定药材品种的结果

通过电子舌、高效液相和显微鉴定的结果分析见表5总结可以看出新宾、通化和清原的龙胆都属于龙胆(粗糙)，他们的味道最苦、质量最好。

表5 各产地龙胆商品药材显微鉴定品种表

4 讨论

以前电子舌广泛的应用于食品领域的研究，但随着医药领域的发展，基于电子舌对医药的研究也逐年增加。例如在药品质量监控，在不同来源的药物差异性对比，预估未知中药提取物浓度和比较中草药主成分的质量优劣等方面都有关联[17]。并且电子舌能够对味道进行客观评价并把相关成分相互作用的内在信息转化成不同味道和质量之间的关系，这使其在客观表述和控制中草药外观气味信息等方面有着广泛的应用空间[18]，也使得中药鉴定更加方便。

本研究采用电子舌技术，对不同产地来源的10批龙胆药材，采用TS-5000Z电子舌系统自带的DBMS数据库系统，采用来自传感器的原始数据进行味觉特征分析。对感官评价数据使用SPSS19.0系统进行主成分分析和聚类分析。采用HPLC法对龙胆药材中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等活性成分进行含量测定研究。基于灰色关联度分析法对龙胆药材苦味与品质的相关性进行分析。最后得到了新宾、通化和清源的龙胆都属于粗糙龙胆，他们的味道最苦、质量最优的结果。

目前在传统中草药质量评估中，人为感觉描述具有较强的主观性，在量化标准、准确度和重复性方面的把握有欠缺，而且中草药的成分极其繁杂，如果用传统的光谱、色谱技术对成分进行定性定量，进而将定量化的指标对应到苦度计算，将会带来非常繁杂和庞大的处理过程[19]。但利用电子舌分析系统对中药成分进行区分，刚好能从混沌分析、整体预测的角度入手，可对样品中成分定性和定量化分析的过程忽略，赋予样品味道和电信号的整体信息。引入电子舌为中草药的快速、便携、准确、稳定的筛选和产品化提供了良好的平台[20]。本实验的结果不但能降低人的感官对中药味道判断的模糊性和不准确性，提高中药鉴别效率和准确度；而且可以初步建立以龙胆药材的苦味来评价药材质量的方法，为中药质量评价提供了新的思路和方法。