川芎中1-(3′，4′-二羟基肉桂酰基)环戊烷-2，3-二醇分离鉴定及含量测定△

罗镭，邵喜英

(1.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052；2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022)

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，为临床常用中药，具有活血行气、祛风止痛之功效，主治胸痹心痛、胸肋刺痛、跌扑肿痛、月经不调、经闭痛经、瘾瘕腹痛、头痛、风湿痹痛[1]。现代药理研究表明，川芎具改善血管内皮功能及冠状动脉血流量、降低血流阻力及血压、抗氧自由基、抗炎、抗癌、抗血小板聚集、抗血栓形成、保护视神经等多种药理活性[2]。目前，研究人员对川芎中挥发油类脂溶性成分研究较多，从中分离得到藁本内酯、洋川芎内酯、川芎三萜等许多脂溶性成分[3-5]，鲜有对川芎中水溶性化学成分研究的报道。然而近年来研究发现，川芎水提液具有治疗和保护脑缺血、冠心病、心绞痛等心脑血管疾病的功能。李喆等[6]发现川芎水提液具有抗氧化作用，能降低一氧化碳、丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶的活性。张晶晶等[7]研究表明，川芎水提液在体外具有较明显的抗氧化活性，其抗氧化效果与浓度呈显著的线性相关。

基于川芎水提液具有显著的抗氧化活性，笔者尝试分离鉴定川芎水提液中抗氧化活性的单体成分。笔者采用反相硅胶、凝胶等柱色谱分离方法，从川芎水提液中分得一水溶性成分1-(3′，4′-二羟基肉桂酰基)环戊烷-2，3-二醇[1-(3′，4′-dihydroxycinnamoyl)cyclopentane-2，3-diol，DC]。DC化学结构新颖，不同于以往报道的洋川芎内酯、藁本内酯等骨架类型，系首次从该植物中分离得到。Wang等[8]从酸樱桃中分离得到该化合物，并经生物活性检测表明该化合物具有很强的抗氧化活性，其抗氧化活性与合成抗氧化剂BHA、BHT的抗氧化活性相当。基于该化合物显著的抗氧化生物活性，本文报道了川芎中DC的含量测定方法，实验表明该方法简便、准确、重复性好，可为川芎药材的质量控制及新药研发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DPX 500型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)，LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，XPE205型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Elmasonic P超声波清洗器(德国Elma公司)。

1.2 试药

收集了5批川芎药材，购自成都市荷花池中药材市场，经浙江省食品药品检验研究院中药所郭增喜主任中药师鉴定为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，标本保存于浙江省食品药品检验研究院中药所。

反相硅胶ODS填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20凝胶(瑞典Parmacia公司)。DC对照品为实验室自制，经1H-NMR、13C-NMR确证结构，经HPLC归一化法测定其纯度>98%，满足定量要求。三氟乙酸、甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 DC的提取、分离和结构鉴定

2.1.1 提取与分离 川芎药材10 kg，用70%乙醇水回流提取(3×2 h)，减压回收溶剂至无醇味，加适量水分散，搅拌，静止，除去沉淀。所得水溶性部位经大孔吸附树脂柱色谱分离，以水-乙醇梯度洗脱，共得到4个部分，分别为Fr.1(水)、Fr.2(30%乙醇)、Fr.3(70%乙醇)和Fr.4(95%乙醇)。Fr.2(95 g)经ODS反相柱色谱，用甲醇-水进行梯度洗脱，共得到50个部分(Fr.2-1 ～Fr.2-50)，其中Fr.2-9 ～Fr.2-14合并，再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到单体化合物DC(250 mg)。

2.1.2 结构鉴定 浅黄色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z281.1[M+H]+；279.1[M-H]-，得出化合物分子量为280.1，结合1H和13C-NMR数据信息，确定化合物分子式为C14H16O6。

1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.04(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.93(1H，dd，J=8.0 Hz，1.8 Hz，H-6′)，7.55(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，6.25(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.34(1H，m，H-1)，3.73(1H，m，H-2)，4.18(1H，m，H-3)，2.15(2H，m，H-4)，1.95(2H，m，H-5)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：128.1(C-1′)，115.3(C-2′)，149.8(C-3′)，147.4(C-4′)，116.8(C-5′)，123.3(C-6′)，147.1(C-7′)，115.6(C-8′)，169.1(C-9′)，72.3(C-1)，74.0(C-2)，71.9(C-3)，38.5(C-4)，39.4(C-5)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定为1-(3′，4′-二羟基肉桂酰基)环戊烷-2，3-二醇。结构式见图1。

图1 1-(3′，4′-二羟基肉桂酰基)环戊烷-2，3-二醇的化学结构

2.2 DC含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 Inertsil ODS-3 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 ～20 min，5%→20%A)，流速为1.0 mL·min-1；检测波长为325 nm，柱温为30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取经减压干燥后的DC对照品5.84 mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.116 8 mg·mL-1对照品储备液。精密吸取对照品储备液3 mL，置于15 mL量瓶中，加70%甲醇水稀释至刻度，摇匀，即得0.023 36 mg·mL-1对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水25 mL，密塞，称定质量，超声处理45 min(功率250 W，频率35 kHz)，放冷，再称定质量，加70%甲醇水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性及专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂各10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱图，见图2。在该色谱条件下，供试品溶液色谱图中具有与对照品溶液色谱图中DC对照品相同保留时间的色谱峰，空白溶剂在此峰位无吸收，证明阴性无干扰。样品中待测目标物与其他成分均可达到基线分离，分离度均大于1.5，分离效果好。

注：A.对照品；B.供试品；C.空白溶剂；1.1-(3′，4′-二羟基肉桂酰基)环戊烷-2，3-二醇。图2 川芎供试品和对照品液相色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取2.2.2项下0.023 36 mg·mL-1对照品溶液1、3、5、10 μL及0.116 8 mg·mL-1对照品贮备液3、5、10 μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=1 481.35X-3 172.54(r=1.000 0)，结果表明DC进样量在0.023 36 ～1.168 0 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 仪器精密度试验 精密吸取0.023 36 mg·mL-1DC对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定色谱峰面积，结果RSD为0.11%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批(批号：160606)川芎药材粉末，按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，依法测定含量，结果川芎中DC的平均含量为1.082 mg·g-1，RSD为 1.61%，表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取2.2.7项下同一供试品溶液，分别在0、2、6、10、14、20 h进样，计算DC峰面积的RSD为0.51%，表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收试验 称取已知含量的川芎药材粉末(批号：160606)6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入DC对照品贮备液2 mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定含量，计算回收率，结果见表1。

表1 川芎中DC加样回收试验结果(n=6)

2.2.10 样品测定 取不同批号的川芎样品0.5 g，每批样品平行3份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，并用外标法计算样品中DC的含量，结果见表2。

表2 川芎样品中DC含量测定结果(n=3)

3 讨论

本实验通过色谱、波谱方法，从川芎水提液中分离鉴定水溶性化学成分DC，该成分系首次从川芎中分离得到。文献报道DC具有很强的抗氧化活性，与合成抗氧化剂BHT、TBHQ活性相当，但合成抗氧化剂存在安全性问题，使其应用受到很大限制，故从传统中药川芎中分得高效无毒的天然抗氧化活性物质DC具有十分重要的意义。

本文比较过超声提取和热回流提取对DC含量测定的影响，结果显示无统计学差异，因超声提取操作方便，故最终选择超声提取。考察过甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作为提取溶剂，超声时间分别为30、45、60 min时的提取效率，实验结果表明最佳提取工艺为70%甲醇超声45 min。本文建立的含量测定方法简便、准确、重复性好，含量测定结果表明川芎中均含有较高含量的DC，可为川芎药材质量标准的制定及资源的开发利用提供参考。