波长切换HPLC同时测定车前草中5个活性成分的含量△

柴瑞平，路娟，王晓静，2，赵颖，吕欣锴，陈曦，3*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学，山东 济南 250355；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

车前草为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.和平车前PlantagodepressaWilld.的干燥全草，具有清热、利尿、通淋、祛痰、凉血解毒的功效，常用于治疗热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痰热咳嗽、臃肿疮毒等疾病[1-4]。作为一味常用中药，始载于《神农本草经》，列为上品[5]。苯乙醇苷类化合物是车前草中极具代表性的成分，目前已经报道的车前草中苯乙醇苷类成分主要有大车前苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷等[4，6-8]。黄酮类化合物[9-11]也是车前草主要有效成分之一，主要有芹菜素、木犀草素、木犀草苷等。2015版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)中，以大车前苷的含量(不得少于0.1%)作为车前草的质控标准，但是文献报道[2，7]均证实了该标准不能全面反映不同产地及不同基原车前草的质量。本研究采用多波长切换的方法对大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素5种成分在最大吸收波长下同时进行测定，以期为进一步制订与提升车前草质控标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity超高效液相色谱仪，配置四元高压泵、自动进样器、PDA 检测器；Mettler AB265-S 电子分析天平(Mettler Toledo仪器有限公司)；LD-T100型中草药粉碎机(上海顶帅电器有限公司)。

1.2 试剂与试药

对照品大车前苷(批号：150930，纯度>98%)、毛蕊花糖苷(批号：160517，纯度>98%)、异毛蕊花糖苷(批号：160917，纯度>98%)、木犀草素(批号：160420，纯度>99%)、芹菜素(批号：160503，纯度>99%)，均购自上海融禾医药科技有限公司。乙腈(色谱纯，Fisher)，甲酸(分析纯，汕头市西陇化工有限公司)，水(屈臣氏去离子水)。

车前草共6批次，分别产自陕西宝鸡(1号，购于秦岭野生中药材批发零售网店)、湖北襄阳(2号，购于亳州中药材市场)、河南信阳(3号，购于信阳正宗大别山农村苏仙石土特产店)、江西吉安(4号，购于北京同仁堂有限责任公司马连洼药店)、山东潍坊(5号，购于王小二的新田园网店)、湖北张家界(6号，购于张家界土家族野生药材店)。经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛副研究员鉴定，1、2、6号药材基原为车前PlantagoasiaticaL.，3、4、5号药材基原为平车前PlantagodepressaWilld.，均为正品，符合《中国药典》相关规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸-水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～15 min，19%A；15～18 min，19%～25%A；18～22 min，25%A；22～27 min，25%～45%A；27～35 min，45%A)；流速：0.8 mL·min-1，检测波长：330 nm(0～29 min)、350 nm(29.01～31 min)和338 nm(31.01～35 min)，柱温：25 ℃，进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品大车前苷10.71 mg、毛蕊花糖苷10.10 mg、异毛蕊花糖苷13.14 mg、木犀草素8.56 mg、芹菜素8.64 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，分别制成以下质量浓度的对照品溶液：大车前苷1.071 mg·mL-1、毛蕊花糖苷1.010 mg·mL-1、异毛蕊花糖苷1.314 mg·mL-1、木犀草素0.856 mg·mL-1、芹菜素0.864 mg·mL-1。移取芹菜素对照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容，得质量浓度为0.043 2 mg·mL-1的芹菜素储备液。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密量取各对照品储备液适量，用甲醇定容，配制成含大车前苷428.4 μg·mL-1、毛蕊花糖苷353.6 μg·mL-1、异毛蕊花糖苷184.0 μg·mL-1、木犀草素8.56 mg·mL-1、芹菜素1.08 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 各产地车前草样品均粉碎后过二号筛，精密称取1号样品0.501 2 g、2号样品1.016 2 g、3号样品1.016 6 g、4号样品1.020 2 g、5号样品0.199 7 g、6号样品1.020 0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密移取60%甲醇25 mL加入锥形瓶中，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减少的质量，过滤，得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液1.6、1.2、0.8、0.4、0.2 mL分别置于2 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，按照2.1色谱条件进样。以对应的对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程和线性范围。将最小质量浓度混合对照品溶液逐级稀释，以仪器信噪比S/N=3时作为最低检测限(LOD)，S/N=10时作为最低定量限(LOQ)，结果见表1。

2.3.2 专属性考察 按照2.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、1号和5号供试品溶液各10 μL进样分析，记录色谱图(见图1)。5种被测成分分离度良好，均能达到基线分离，本方法专属性良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液，按照2.1色谱条件连续进样6次，测得大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD分别为0.78%、1.03%、0.95%、1.51%和1.62%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取1号样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按照2.1色谱条件进行测定，测得大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD分别为1.05%、0.82%、1.22%、1.85%、2.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

注：A.混合对照品；B.1号样品；C.5号样品；1.大车前苷；2.毛蕊花糖苷；3.异毛蕊花糖苷；4.木犀草素；5.芹菜素。图1 混合对照品及车前草供试样品HPLC图

2.3.5 重复性试验 取1号样品粉末约0.5 g，共6份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算含量。结果6份样品中，大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素含量的RSD分别为0.96%、1.29%、1.13%、1.52%和2.35%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的1号样品粉末约0.25 g，共6份，精密称定，每份中精密加入按照2.2.2项下配制的混合对照品溶液4 mL，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定，结果见表2、3。由表中各成分平均回收率及RSD可以看出，该方法加样回收率符合要求。

表1 5个活性成分的回归方程、线性范围、定量限及检测限测定结果

表2 车前草中大车前苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的加样回收率试验结果

续表2

表3 车前草中木犀草素和芹菜素的加样回收率试验结果

2.4 样品含量测定

取2.2.3供试品溶液，按照2.1色谱条件进行含量测定，计算1～6号供试品中各成分的含量，结果见表4。

表4 车前草中5个活性成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

注：-表示含量未达到检测限

3 讨论

从表4可以看出，不同产地的车前草样品中各成分的含量差异较大，1号、2号、3号和6号样品中大车前苷含量均达到了《中国药典》中规定的含量限度，其中1号样品中大车前苷含量最高。4号和5号样品中未检测到大车前苷的存在，以毛蕊花糖苷为主成分，其中5号样品中毛蕊花糖苷含量最高。1号陕西宝鸡样品中5种成分的含量均较高，质量最佳，这可能与土壤、采收季节、基原和环境等因素有关。因此以单一成分大车前苷作为中药的质控指标不足以反映其整体信息，多成分同时进行定量，可以准确地控制车前草的质量，保证中药质量的稳定性。

中药成分复杂，在一个波长下难以体现所有成分的特征，故采用波长切换法。大车前苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为苯乙醇苷类化合物，苯乙醇苷类化合物在220、247、290、330 nm均有较大吸收，一般选择样品杂峰数目更少的330 nm作为检测波长[4]。木犀草素最大吸收波长为350 nm[12]，芹菜素最大吸收波长选择338 nm[13]。

本研究建立的多波长切换HPLC用于车前草药材中大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草素和芹菜素含量的同时测定，通过方法学考察表明该方法准确、简单。实验测得不同产地车前草药材质量存在较大差异，所以需要用多成分同时定量以保证药材质量稳定性，该方法可以为车前草药材的质量控制提供参考。