丁香酚在罗非鱼体内的代谢和休药期研究

2020-10-28林丽聪樊海平王茂元钟全福曾占壮

渔业研究 2020年5期

林丽聪，樊海平，王茂元，钟全福，曾占壮

(福建省淡水水产研究所，福建福州 350002)

罗非鱼(Oreochromsmossambcus)属热带鱼类，因富含不饱和脂肪酸和蛋白质，肉质细嫩，味道鲜美，已成为我国乃至世界水产业的优质养殖鱼类之一[1]。我国南方地理环境及气候有利于罗非鱼的生长，而北方则不然，罗非鱼养殖出现南多北少的局面。随着经济的快速增长，人们对活鱼需求量急剧上涨，罗非鱼大多以鲜活运输的方式销往全国各地[2]。在运输过程中，罗非鱼应激反应强烈，鱼鳍坚硬锋利，容易被彼此刺伤。因而，为确保罗非鱼的鲜活运输，有必要在运输前将其麻醉。丁香酚(Eugenol)，化学名为2-甲氧-4-丙烯基酚，分子式为C10H12O2[3]，自20世纪70年代初发现其对鱼类有强烈的麻醉作用后，以其高性价比在水产行业被广泛使用[4]。近年来，国内外科研人员相继开展了丁香酚在不同种类水产品中的麻醉效果研究，取得了相应的应用数据[5-6]。但丁香酚作为渔用麻醉剂，其安全性在国际上还存在一定的争议。日本允许使用丁香酚为渔用麻醉剂，但规定了药浴剂量范围和最高残留限量值(MRL)分别为50～200 mg/kg 和0.05 mg/kg[4，7]；美国、加拿大则因其安全性的不确定性，不允许其作为渔用麻醉剂使用[7-8]；我国相关部门对丁香酚是否可以作为渔用麻醉剂使用，暂无明确规定，但据调查显示，我国水产品流通环节常使用丁香酚麻醉运输活鱼[9]。丁香酚能有效减少罗非鱼在运输过程中的应激反应，因运输过程长，从业人员通常采用加大剂量来维持麻醉效果[10]，但缺少休药期意识，使销售环节及餐桌上罗非鱼中丁香酚残留的风险增加[11]。目前国内对于丁香酚在罗非鱼体内的药动学研究有：韩典峰等[12]采用45 mg/L丁香酚对罗非鱼进行麻醉，在进入完全麻醉阶段后(3 min)，捞出放入清水中进行复苏，并研究复苏后0～18 h罗非鱼血浆中的药代动力学，结果发现丁香酚在罗非鱼血浆中半衰期短，消除速率快；孙宇航等[13]采用30 mg/L丁香酚药浴罗非鱼24 h，于苏醒后的0～96 h进行采样，研究罗非鱼血浆、肝和肌肉中的药代动力学参数，结果表明丁香酚在鱼类组织中分布广、消除慢、停留时间长。国内虽然已对丁香酚在罗非鱼体内的药代动力学进行研究，但未见对相应的休药期进行规定。

本试验针对目前罗非鱼活鱼普遍采用低浓度、长时间麻醉运输(运输时间一般不超过24 h)以提高存活率，降低损耗的情况，选择既能保证麻醉效果又能保证罗非鱼存活的丁香酚浓度(20 mg/L)对罗非鱼进行麻醉24 h后，间隔采样至罗非鱼血浆和肌肉中未检出丁香酚残留或丁香酚浓度低于最高残留限量，并进行药代动力学及休药期的研究，为丁香酚在罗非鱼体内休药期的制订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼

试验用新吉富罗非鱼，由福建省淡水水产研究所榕桥中试基地罗非鱼商品鱼养殖池塘捞取，平均体质量为(250±10)g，并暂养于实验室水体1 000 L的养殖桶中，试验鱼经随机抽样检测无丁香酚残留，水温控制在(25±1)℃，每天按鱼体质量的1.5%～2%投喂罗非鱼膨化饲料(福建海马饲料有限公司生产)，早晚各投喂1次，每次投喂后1 h排污放水25%。暂养及试验期间24 h增氧，暂养稳定后进行试验。

1.1.2 试验仪器

超高效液相色谱-串联质谱联用仪(WatersTQ-XS)；BT-Ⅱ水浴式氮吹仪(北京踏锦科技有限公司)；超纯水机(美国Millipore公司)；离心机(美国Sigma公司)；旋涡振荡器(德国IKA公司)；电子天平(德国Sartorius公司)等。

1.1.3 药品与试剂

丁香酚原料药(纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司)；丁香酚标准品(纯度≥98%，北京百灵威科技有限公司)；丁香酚-D3内标物(纯度≥98%，美国Accustandard公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Fisher公司)；正己烷为分析纯(国药集团化学试剂公司)；吐温-80(中国医药集团上海化学试剂公司)；肝素钠注射液(天津生物化学制药有限公司)。

1.2 试验方法

选取体质量为(250±10)g的健康罗非鱼200尾，试验前2 d停止喂食。试验开始前0.5 h配制丁香酚溶液，将丁香酚与吐温-80(质量比为1∶1)混合。将配置好的丁香酚溶液倒入曝过气的水中，充分搅拌均匀，配置成20 mg/L的丁香酚溶液。另取10尾不给药，作为空白对照组。

罗非鱼以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后捞出放入清水中，分别于捞出后0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、2 d、3 d、6 d、10 d、15 d、30 d 采集罗非鱼血液(采用心脏采血)和肌肉，每个采样点采10尾，每2尾一组，共5个平行。血液置于10 mL肝素钠离心管中混匀，4 000 r·min-1离心5 min分离血浆，血浆、肌肉于-80℃保存备用。

1.3 样品处理及测定

血浆和肌肉样品的前处理及测定方法参照林丽聪[2]的方法：在1.0～100.0 μg/L线性范围内，丁香酚在罗非鱼血浆中的标准曲线方程为Y=1 467X-272，相关系数r=0.998 5，准确度为97.0%～98.9%，精密度在1.14%～2.21%之间，定量限达到2.0 μg/L。在1.0～90.0 μg/kg线性范围内，丁香酚在罗非鱼肌肉中的标准曲线方程为Y=0.015 4X-0.002 5，相关系数r=0.999 8，准确度为90.2%～95.9%，精密度在1.91%～5.28%之间，定量限达到2.0 μg/kg。满足罗非鱼血浆和肌肉中丁香酚的残留检测要求。

1.4 数据处理

利用药动学软件PKS[14]处理罗非鱼药浴丁香酚后的药物浓度-时间数据(C-T)，拟合最佳药动学模型，推导药动学参数，给出丁香酚在罗非鱼体内的代谢过程。

2 结果与分析

2.1 不同浓度丁香酚对罗非鱼的麻醉效果

将配置好的丁香酚溶液倒入水中，充分搅拌均匀，分别配置成浓度为5、10、15、20、25、30 mg/L的水体。选取体质量为(250±10)g的罗非鱼，分为6组，每组10尾鱼，鱼水比例控制在2∶3左右[15]，每组均设置3个平行。将6组鱼分别放入不同浓度的水体中进行药浴麻醉24 h，结果显示丁香酚浓度为5、10、15 mg/L的水体中，因浓度较低，罗非鱼未能保持麻醉状态，达不到长途运输的麻醉效果；在丁香酚浓度为20 mg/L的水体中，罗非鱼能保持很好的麻醉状态，复苏比例可达100%；而在浓度为25 mg/L及30 mg/L的水体中，因麻醉浓度偏高，罗非鱼存活比例分别为20%和0%。因此，选择既能保证麻醉效果又能保证罗非鱼存活的20 mg/L为罗非鱼的麻醉浓度。本研究结果同李宁等[16]研究的丁香酚浓度为10 mg/L及15 mg/L时，鲈鱼只能进入深度镇静状态；而浓度达到20 mg/L时，鲈鱼会进入麻醉期，24 h后存活率为100%；丁香酚浓度为25～30 mg/L时，鲈鱼麻醉24 h后不能全部复苏结果相似。

2.2 丁香酚在罗非鱼体内的浓度变化及代谢动力学特征

采用20 mg/L丁香酚药浴后，罗非鱼血浆和肌肉中的药物经时过程均符合一级吸收一室开放模型，其理论方程分别为：C血浆=4.762(e-0.062 6 t-e-0.064 7 t)、C肌肉=1.089(e-0.006 9 t-e-0.002 17 t)。丁香酚在罗非鱼体内的浓度见表1。

表1 罗非鱼药浴丁香酚后血浆和肌肉中药物浓度(n=5)Tab.1 Concentration of eugenol in plasma and muscle of tilapia after medicated bath(n=5)

2.3 丁香酚在罗非鱼体内的药物代谢动力学参数

丁香酚在罗非鱼体内的主要药动学参数见表2、药时曲线见图1。可见，丁香酚在罗非鱼肌肉中药时曲线下面积(AUC)较血浆中大，说明肌肉中丁香酚的生物利用度较高，有较多分布，但其吸收半衰期(T1/2ka)及消除半衰期(T1/2ke)显著慢于血浆，清除率(CL/F)也偏小；表明丁香酚在罗非鱼肌肉中消除缓慢，滞留时间较长。

表2 丁香酚在罗非鱼体内的药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of eugenol in tilapia

3 讨论

3.1 麻醉溶液的配制

本研究丁香酚采用无水乙醇助溶进行预实验[12-13，17]，经观察发现，丁香酚溶于无水乙醇后，在水体中容易析出丁香酚油滴，罗非鱼可能直接吞食油滴，平行对照试验相对标准偏差大于60%，结果无重复性。而采用吐温-80为乳化剂，与丁香酚按1∶1溶解后，在水中搅拌均匀后无油滴析出，平行对照试验相对标准偏差小于10%，结果重复性好。因此，本试验选择吐温-80为助溶剂。

3.2 丁香酚在罗非鱼中的代谢特征

以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后，罗非鱼血浆中的药-时曲线出现双峰现象，肌肉中则出现3个峰浓度，血浆和肌肉中丁香酚浓度均在药浴24 h后即采样点为0 h时处于峰值，峰值之后浓度迅速下降，且第二次达峰时间均为8 h，峰浓度均低于第一个峰浓度，接着血浆中丁香酚浓度逐渐下降，而肌肉中丁香酚浓度在72 h时又出现一个峰值。这种现象在刘海新等[18]进行丁香酚在斜带髭鲷体内的残留研究时也出现过：斜带髭鲷经丁香酚麻醉8 h后放入海水中复苏，其体内丁香酚浓度快速下降，复苏过程血浆和组织中丁香酚也出现浓度反复现象，可能与某些脏器对药物存在再吸收有关，如肝肠循环、胃肠循环的作用。类似情况还出现在凡纳滨对虾[19]中，丁香酚为苯酚共轭化合物，在动物体内代谢过程中，容易出现再循环现象。

从表1、表2可以看出，丁香酚在血浆中的最高浓度高于肌肉，消除半衰期却比肌肉短，说明丁香酚在罗非鱼血浆中代谢较快，在肌肉中消除缓慢。李宁等[16]研究了丁香酚在大口黑鲈中的代谢残留，将大口黑鲈放置于20 mg/L的丁香酚中麻醉24 h后，并在清水中复苏4 d后，丁香酚才基本消除完全，说明经长时间麻醉后，丁香酚在鱼体内容易保持长时间低浓度存在。

3.3 丁香酚在罗非鱼体内的休药期

以日本规定的水产品中丁香酚最高残留限量(MRL)为0.05 mg/kg为标准，根据丁香酚在罗非鱼血浆和肌肉中的药物经时过程理论方程及规定的最高残留限量计算休药期。在水温(25±1)℃，罗非鱼以20 mg/L丁香酚溶液麻醉24 h后，罗非鱼血浆在药浴后25.7 h即达到安全水平，而肌肉中因多次出现达峰现象，且消除缓慢，需在药浴后270 h即约12 d后才符合规定。本研究结果同韩典峰等[12]及孙宇航等[13]的研究结果相似，即丁香酚在罗非鱼血浆中半衰期短、消除速率快，在鱼类组织中比在血浆中消除慢。