浓香型白酒窖泥中产己酸菌的研究进展

唐伟斌，王海丽，宫彬彬，李 林，王子权，王梦娇，钱含微，姚亚辉，许长峰*

（邢台学院生物科学与工程学院，河北 邢台 054001）

白酒文化源远流长，早在4 000～5 000年前的“龙山文化”时期，已有谷物制酒。浓香型作为白酒十二香型中的主要香型，其具备窖香浓郁、绵甜醇厚、香味谐调、尾味净爽等特点，深受广大人民的喜爱。影响白酒风味的因素有浓香型白酒窖泥中微生物、窖泥的理化指标、窖泥年份等[1-3]。己酸乙酯是浓香型白酒的主要风味物质，己酸作为己酸乙酯合成的前体，己酸的产量决定着己酸乙酯的产量。而浓香型白酒窖泥中的己酸菌可以产生己酸[4]，对其进行生产工艺优化可为浓香型白酒的工业化生产提供参考[5]。因此，获得高产己酸的菌株对于提高浓香型白酒的品质具有重要意义。

该文从以下几个方面综述了浓香型白酒窖泥中产己酸菌的研究进展，分别为产己酸菌的种类、形态特征、代谢途径及分离筛选；不同培养条件如乳酸亚铁、不同碳源、不同氮源对产己酸菌的影响；产己酸菌与酵母菌、放线菌以及产甲烷菌等不同菌种共培养以及产己酸菌在窖池养护等实际中的应用。以期有助于浓香型白酒的提质増香。

1 产己酸菌研究概况

1.1 产己酸菌的种类及形态特征

产己酸菌是一类能够利用乙醇、葡萄糖、半乳糖等有机碳源产生己酸的微生物统称。其种类包括梭菌属（Clostridium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）等[6-10]。产己酸菌是白酒生产过程中一类非常重要的微生物，其细胞长约1.94～3.35 μm、宽约0.51～0.75 μm，游离孢子呈圆形，宽约0.15～0.18 μm，菌落形态多样，适宜在中性偏酸的环境中生存。产己酸菌种类不同，细胞形态和菌落特征各异，细胞多为杆状、梭状，菌落形态多为圆形、表面光滑，颜色为白色、黄色或浅黄色。其中芽孢杆菌属（Bacillus）为厌氧或兼性厌氧，梭菌属（Clostridium）和埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）为严格厌氧菌，窖泥、酒糟及牛胃等为缺氧环境，适宜厌氧己酸菌的生长繁殖。产己酸菌的种类、来源及特征见表1。

表1 产己酸菌种类、来源与特征Table 1 Species, origin and characteristics of caproic acid-producing bacteria

1.2 产己酸菌的代谢途径

产己酸菌的代谢途径为梭菌属代谢途径（见图1）。梭菌属通过逆β氧化途径产生己酸[15-17]，首先乙醇或乳酸被氧化成乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），继而与乙酸缩合产生丁酸，丁酸再与另一个乙酰辅酶A缩合产生己酸[18-19]。在此过程中，原料乙酸过量会造成丁酸产量增加，而乙醇过量则会造成己酸含量增加，因此在酿酒过程中应注意提升乙醇的含量，以提高白酒品质[20-22]。但是谢圣凯等[23]筛选出两株在不添加乙醇的条件下仍能产生己酸的产己酸菌菌株，证明了产己酸菌产生己酸的代谢不一定要以乙醇为基础。任聪等[24]的供试样品中梭菌属的丰度约为0.12%，推测该样品中的主体产己酸菌并不属于梭菌属。朱晓军[17]实验所用的四川浓香型白酒厂窖泥混菌的己酸产量可达6.68 mg/mL，窖泥热激混菌特定种属聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）验证中，未发现克氏梭菌（Clostridium kluyveri）基因组。因此在实际的浓香型白酒酿造体系中，可能存在除克氏梭菌逆β氧化以外的其他己酸途径，但其他己酸代谢途径还鲜见报道。

图1 梭菌属细菌产己酸的代谢途径Fig. 1 Metabolic pathways of caproic acid production by Clostridium bacteria

1.3 产己酸菌的分离和筛选

产己酸菌多产生孢子，抗热性强，可在80 ℃热水中存活，且多为厌氧或兼性厌氧菌，适宜厌氧条件下筛选。产己酸菌的筛选一般先经过热激除去非目标菌株，再通过特制的产己酸菌筛选培养基进行厌氧培养后，采用硫酸铜颜色反应初筛，在发酵液中加入一定量硫酸铜和乙醚，如发酵液变蓝，则初步判断菌株产己酸。将发酵液稀释涂布平板，挑取单菌厌氧培养进行菌种复筛，发酵液采用气相色谱或气质联用方法测定己酸含量，确定产己酸菌株。杨菁瑾等[25]在泸州老窖中采用真空干燥法分离出的产己酸菌中芽孢杆菌属为优势菌属。彭兵等[26]通过真空干燥法筛选出一株优质产己酸菌菌株并将其命名为克氏梭菌JZZ，该菌株属于梭菌属，己酸产酸量最高可达到4.36 mg/mL。张家庆[27]通过真空干燥法经过多次筛选，从优质老窖泥中分离出一株产己酸菌株，己酸产量可达4.32 mg/mL。张应刚[28]利用厌氧滚管方法筛选出产己酸菌梭菌属菌株JN-1，己酸产量为2.82 mg/mL。刘宏媛等[29]通过真空干燥法在老窖泥中筛选出来适合偏酸环境的两株产己酸菌菌株，己酸产量为5.47 mg/mL。朱晓军[17]在葡萄糖-乙酸钠-丁酸钠增强培养基基础上通过热激、不热激对比方法分离出一株葡萄糖营养型的严格厌氧的梭菌属产己酸菌，己酸产量最高为2.75 mg/mL。赵晨婕等[13]在优质老窖泥中筛选出3株高产己酸菌菌株，其中菌株克氏梭菌A-3具有pH值、温度、乙醇耐受范围广、己酸产量高等优良性状，己酸产量为9.77 mg/mL。

2 不同培养条件对产己酸菌的影响

2.1 乳酸亚铁对产己酸菌的影响

产己酸菌适宜生长的pH为5.0～7.0，在长时间的白酒生产过程中，发酵体系的pH值会不断降低，窖泥表面会变得僵硬，生成以乳酸亚铁为主的白色结晶体，这些白色晶体会对产己酸菌的生长和代谢造成不利的影响，己酸产量降低，从而使香味物质己酸乙酯减少，酒香降低[30]，且乳酸亚铁会破坏细菌细胞膜，使细胞内含物外泄。孙春丽等[31]对产己酸菌ZH-5进行研究，发现乳酸亚铁会抑制细菌的浓度，且浓度越高抑制能力越强。因此，在窖泥的养护过程中应注意避免发酵体系pH值的降低及乳酸亚铁的生成。崔凤元等[32]在发酵体系中添加醋酸钠可以使体系的pH值升高，延缓乳酸亚铁的形成，使窖池的环境更适合产己酸菌生存，产己酸菌数量增加，己酸乙酯的含量提高0.31 mg/mL。

2.2 不同碳源对产己酸菌的影响

产己酸菌对不同碳源的依赖程度不同。薛正楷等[30]对菌株K-2进行研究，证明其可利用葡萄糖、甘露醇、菊糖、阿拉伯糖、蔗糖等多种碳源生成己酸。谢彪等[33]在对菌种js-22-07进行发酵条件优化的研究中发现，该菌株利用乙醇作为碳源时，己酸产量显著高于乙酸、葡萄糖等作为碳源时的己酸产量（P＜0.05）。韩珍琼等[34]筛选出的产己酸菌在乙醇体积分数为2%～3%之间时活菌数较多且生长状态良好，当乙醇体积分数＞6%，产己酸菌生长受到抑制甚至死亡，表明乙醇体积分数在产己酸菌的生长过程中有一定影响。赵晨婕等[13]筛选出的产己酸菌A-3在乙醇体积分数为2%时产酸量最高，为6.22 mg/mL。朱晓军[17]的研究结果表明，窖泥混菌可以用葡萄糖作为碳源，与乙醇作为碳源对比，己酸产量有显著提高，最高达6.68 mg/mL。还有研究表明，以葡萄糖作为碳源富集窖泥中产己酸菌菌群的效果较以乳酸作为碳源有显著提升[35]，这可能是由于不同产己酸菌的碳源代谢途径和其酶活性导致的。

2.3 不同氮源对产己酸菌的影响

氮元素是生物不可缺少的元素，可组成微生物所必须的氨基酸、蛋白质和核酸等物质[36]。氮元素可提高产己酸菌的己酸产量。谢彪等[33]筛选自酒窖窖泥的梭状芽胞杆菌（Bacillus megaterium）以硫酸铵（（NH4）2SO4）作为氮源时产己酸能力较强，而菌株以硝酸钠（NaNO3）作为氮源时产己酸能力较弱。姚万春等[37]研究了5种氮源对己酸菌生长和代谢的影响，发现产己酸菌可利用有机氮源和（NH4）2SO4，对硝酸盐的利用较差。任静等[38]研究了不同氨基酸对产己酸菌产己酸的影响，发现L-亮氨酸含量为0.2%、L-赖氨酸含量为0.1%时，己酸产量最高为4.77 mg/mL。马业准[39]在培养基中加入0.2%的L-亮氨酸或L-赖氨酸使己酸产量增加至4.70 mg/mL。

3 产己酸菌与不同菌种共培养

窖池是一个小的微生态系统，微生物资源丰富，对产己酸菌的研究不能只局限于菌株自身，对窖泥中其他菌种进行研究也十分重要。随着微生物的生长，其发酵体系的温度、pH、营养物质都可能随之改变，部分菌株可以使发酵体系朝着更适合产己酸菌生长代谢的方向发展。但是由于窖泥中的微生物多样性，人们对产己酸菌与其他菌种之间共同培养的作用机制仍然不了解。因此，有必要对产己酸菌与不同菌种共培养进行研究，以期探究其提高己酸产量的机制。

3.1 产己酸菌与酵母菌共培养

杨爱华等[40]分别将3株产己酸菌与酵母菌混合培养，发现混合体系的乙酸、丁酸及己酸产量均有显著提高，后又分别将这3株产己酸菌与酵母粉进行混合发酵，但总酸产量并没有提高，可能已酸产量提高不是由于酵母为己酸菌提供营养物质的原因。嵇翔等[41]将梭菌属菌株8022与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合培养，总酸产量增加12.5%。产己酸菌为厌氧菌或兼性厌氧菌，白酒发酵过程中会消耗窖泥中的氧气，使窖泥形成一种厌氧或半厌氧状态。窖泥中含有多种微生物，各种微生物协同合作，共同生长，不适应这种环境的微生物则被淘汰。由于酵母菌的加入使氧气含量降低，缺氧环境促进了乙酸缩合成丁酸，丁酸缩合成己酸的过程，从而导致己酸产量提高。

3.2 产己酸菌与放线菌共培养

放线菌为革兰氏阳性菌，繁殖方式分为孢子繁殖为主，存在于土壤、水以及空气等地。目前放线菌主要用于抗生素、甾体、抗癌剂、抗寄生虫剂、维生素、酶、杀虫剂的生产以及污水处理等方面[42]。浓香型白酒发酵体系中的放线菌主要由酒曲和窖泥提供，人们在多年以前就发现了放线菌与产己酸菌共同培养可以使己酸产量提高[43]。因此，研究产己酸菌与放线菌共培养提高己酸产量的机制是白酒提质増香的一个重要研究方向。

刘延波等[44]分析了浓香型白酒高温曲的菌种群落结构，其中放线菌门（Actinobacteria）占3.87%。郭威等[45]筛选出了一株促己酸菌产乙酸且良好适应窖池环境的放线菌菌株，将其命名为GW01。在其后续的研究中发现由菌株GW01产生的具有抗氧化作用，能清除自由基的黑色素是己酸产量增加的促进因子。施思等[46]通过放线菌与产己酸菌复配发酵，证明放线菌通过调控丙酮酸代谢、硫代谢、糖酵解途径、苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢及半乳糖的代谢能够增加己酸产量降低乳酸产量。有研究表明，放线菌具有蛋白酶活性、纤维素酶活性、淀粉酶活性、明胶酶活性。放线菌能够利用蛋白酶分解大分子蛋白质，形成能被产己酸菌利用的小分子物质，促进产己酸菌的生长繁殖，能够利用纤维素酶分解纤维素产生葡萄糖，利用淀粉酶分解淀粉产生葡萄糖，产己酸菌利用放线菌产生的葡萄糖生成己酸。因此，放线菌与产己酸菌的共培养可提高己酸菌的产酸能力[47]。放线菌与产己酸菌共培养为提高己酸产量提供了新途径。可筛选、选育具备多种分解酶、高酶活的放线菌应用于酿酒以提升白酒品质。

3.3 产己酸菌与甲烷菌共培养

甲烷菌是一类严格厌氧的原核微生物，无法在有氧气的环境中生存，所以甲烷菌分离及培养的难度较大，所需成本也较高。尽管研究产己酸菌与甲烷菌的相互作用较为困难，但是已有关于其共培养提高己酸产量的研究报道。

甲烷菌和产己酸菌是互利共生关系，窖泥的好坏不仅与产己酸菌有关，也与甲烷菌有密切关系。产己酸菌在生长代谢过程中会生成H2和CO2，它们可以抑制己酸菌的生长繁殖，在严格厌氧条件下甲烷菌可以利用其他微生物代谢的乙酸、H2和CO2转化为CH4和水，消除产H2和CO2对己酸菌代谢的抑制作用，使己酸产量提高。张应刚[28]在白酒发酵体系中添加了甲烷菌，使黄水中的己酸、丁酸和乙酸的含量显著提高，同时还降低了白酒发酵体系中甲醇的含量，提升了白酒的质量。甲烷菌和产己酸菌皆适合厌氧环境，相比于新窖泥，老窖泥中两者的含量均呈现增加趋势。产己酸菌利用乙醇产生丁酸时会产生氢，氢会抑制产己酸菌的生长。甲烷菌能够利用氢来产生有机物供自身生长，从而解除产己酸菌的氢抑制现象，且产生的甲烷能够刺激产己酸菌产己酸。产己酸菌与甲烷菌相互耦连，实现“种间氢转移”。由于甲烷菌的存在，窖泥中能够出现多种产氢型的发酵反应，促进了有机酸的形成，进而促进了己酸乙酯的含量，提高白酒的品质。窖泥中甲烷菌和产己酸菌的含量也可以作为窖泥质量的判断标准，窖泥中两者含量高说明窖泥品质较好。

4 产己酸菌的实际应用

4.1 产己酸菌使用次数与复壮对己酸产量的影响

产己酸菌在实际应用过程中会逐渐沾染杂菌，这些杂菌会对产己酸菌的生长及代谢产生不利的影响，在多次使用后就需要对其进行热处理以去除杂菌和复壮。赵德义等[48]指出，一般产己酸菌使用3轮后，杂菌数量就会显著增多，导致己酸产量下降，所以每使用3轮左右就需要对产己酸菌进行一次复壮。杨爱华等[40]对3株产己酸菌菌株进行热处理，初次进行热处理，产己酸菌数量会下降，但经过多次加热处理后活菌数量基本保持不变，己酸产量得以提高。

4.2 产己酸菌在窖池养护中的作用

浓香型白酒是中国白酒中最受消费者喜爱的白酒香型，品质优良的窖泥可以酿造出更加优质的白酒。窖泥经过长时间的使用会出现板结、析出以乳酸亚铁为主的白色结晶体等退化现象，导致产己酸菌的产酸量下降，甚至会使产己酸菌死亡，使己酸乙酯等香体成分含量降低。为了稳定并提高白酒质量，就必须对窖泥进行养护，目前高浓度的己酸菌发酵液已应用于窖泥的养护及人工窖泥的快速老熟。

彭兵等[49]采用正交设计方法，以己酸菌和窖泥复合菌液为菌种，以己酸产量为评价指标，考察营养液初始培养基对己酸产量的影响，获得了最优窖泥营养液配方。桑其明等[50]使用多元化窖泥养护液对新建3年的窖池进行了两年养护后，新窖泥的理化指标、微生物指标及产酯能力与30年的成熟窖泥的指标相近。杜礼泉等[51]的研究表明，采用己酸菌、液体窖泥菌液∶窖泥复合功能菌液（1∶1）对新窖泥的养护效果最佳；采用己酸菌、液体窖泥菌液∶窖泥复合功能菌液（1∶2）对退化窖泥的养护效果最佳。

窖泥的养护是一个系统性的、长期的工作，并不是所有的窖泥都能在短时间内变成优质的窖泥，应当严格筛选窖泥及菌种来源，这样才能更容易培养出更优质的窖泥，获得更高质量的白酒。然而，即使是非常优质的窖泥，也不能保证窖泥会一直朝着更优质的方向转变，只有合理养护窖泥才能使窖泥不退化，更优质。

5 展望

目前，关于浓香型白酒窖泥中产己酸菌的研究集中在产己酸菌的分离和筛选、产己酸菌和其他菌种共培养，人工窖泥的老熟以及窖池养护等方面。为提高浓香型白酒窖泥中的产己酸菌产酸能力，可采取以下措施：筛选兼性厌氧型高产己酸菌，选择铁离子含量低的土壤制备人工窖泥，适当添加醋酸钠调节pH值，选择合适的碳源、氮源，调整产己酸菌与酵母菌、放线菌和甲烷菌的共培养比例。在实际生产中注意窖泥的工作，提升己酸产量和白酒品质，降低研发成本。