高通量测序法对不同地域浓香型大曲微生物结构的分析

谭崇尧，徐 军

（湖北枝江酒业股份有限公司，湖北枝江443200）

中国白酒历史悠久，工艺独特，是中华民族的瑰宝。中国白酒受气候、土质、水质等自然因素以及历史、文化、消费习惯等社会因素的影响，各地白酒更呈现不同的风格组成，在科技工作者及酿酒企业的共同努力下，中国白酒逐步形成和确立了酱香型、清香型、浓香型、米香型、凤香型等十二大香型。浓香型大曲酒占全国白酒产销量的70%，国家级名酒中浓香型约占50%。由于浓香型白酒市场大，生产厂家多，目前行业公认的浓香型白酒在风格上又划分为北方派、江淮派和川派等。不同派别的浓香型白酒各有特点。2015年，乔晓梅[1]利用高通量测序技术分析了清香型白酒大曲中真菌群落结构。本文以浓香型白酒为研究对象，利用目前较为先进的高通量测序分析技术对不同地域的大曲真菌和细菌群落结构进行取样分析，样品来源于北方派、长江中游派、江淮派和川派等代表企业。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：来自北方派、长江中游派、江淮派和川派等代表企业大曲。

试剂：PBS缓冲溶液（pH7.0），无水乙醇，氯仿，10×TE Buffer，1%的琼脂糖凝胶，Trans15k Marker，DL2000 DNA Marker，2×PCR Mix Buffer。

仪器设备：TG16-W微量高速离心机，PCR仪（ABI），凝胶成像仪，电泳槽，Miseq高通量测序平台，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

大曲样品的准备、大曲总DNA的提取、PCR扩增和高通量测序、文库建立及数据分析见参考文献[2]。

2 结果与分析

2.1 不同地域大曲真菌群落结构分析（图1）

从图1可以看出，长江中游地区和江淮地区的浓香型白酒大曲真菌主要为曲霉属，数量占50%以上；北方地区和四川地区的白酒大曲差异较大，地域共性不如长江中游和江淮区域明显，如川派的15号、17号和19号的优势真菌为热子囊菌属和嗜热真菌属这类高温菌，而16号和18号则为曲霉属；而北方派主要呈现以酵母（异常维克汉姆酵母）和嗜热高温菌（热子囊菌属和嗜热真菌属）为主要优势菌的差异。

图1 不同地域浓香型白酒大曲真菌群落结构

2.2 不同地域大曲细菌群落结构分析（图2）

图2 不同地域浓香型白酒大曲细菌群落结构

不同地域浓香型大曲细菌群落结构分析如图2，从图2中可以看出，同为浓香型白酒大曲，微生物结构有其相同地方，但各企业大曲微生物构成均存在差异。浓香大曲中原核微生物主要为厚壁菌门，其中乳酸菌群为优势菌，部分样品还有高温嗜热菌、丙酸菌和Rheinheimera。

图3 四川地区浓香型大曲细菌群落结构

2.2.1 川派大曲细菌群落结构分析

从属分类水平上，四川地区5种大曲的主要微生物结构数量图见图3，热图见图4。结果表明，样品1的数量超过10%的细菌为柠檬酸菌属（Citrobacter）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄酒菌属（Staphylococcus)和丙酸菌属（Propionibacterium），数量分别占15.7%、15.4%、12.1%和11.6%；样品2的数量超过10%的细菌为丙酸菌属、Rheinheimera和Desmospora3个菌属，数量分别占20.46%、18.49%和12.0%；样品3的数量超过10%的细菌为乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和芽孢杆菌属（Bacillus），数量分别占20.28%、10.59%和10.28%；样品4的数量超过10%的细菌为Rheinheimera、乳杆菌属和魏斯氏菌属，数量分别占38.74%、14.26%和12.64%；样品5的数量超过10%的细菌仅为高温放线菌属（Thermoactinomyces），数量占62.35%。

浓香型大曲的微生物组成复杂，主要来源于原料和生产环境，受制曲工艺影响，如制曲温度。样品5为典型的高温曲，其中高温放线菌属数量超过60%，芽孢杆菌属含量为7.77%，这两种菌都为嗜热微生物，能够在温度较高的制曲条件下生长、繁殖和代谢，其产生的酶在高温条件下具有很高的活性和热稳定性，是白酒特殊风味物质的重要来源之一。

数量超过10%的细菌在5个大曲中出现两次的菌属为乳杆菌属、魏斯氏菌属、丙酸菌属和Rheinheimera；除此之外，含量较高的菌还有葡萄酒菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、芽孢杆菌属等。

图4 四川地区浓香型大曲细菌群落热图分析

2.2.2 北方派大曲细菌群落结构分析

从属分类水平上，北方地区5种大曲的细菌群落结构数量图见图5。结果表明，22号样品的优势菌为糖球菌和高温放线菌，数量分别占53.7%和23.0%；24号样品的优势菌为葡萄球菌和真丝菌，数量分别占55.8%和22.8%；12号样品的优势菌为高温放线菌和丙酸菌，数量分别占40.9%和27.3%；13号样品的优势菌为链孢子菌属和丙酸菌属，数量分别占42.7%和21.5%；14号样品的优势菌为魏斯氏菌属、高温放线菌属和葡萄球菌属，数量分别占27.2%、20.8%和14.4%。热裸单胞菌属、高温放线菌属、真丝菌属、链孢子菌属和芽孢杆菌属都为嗜热高温菌，5个样品的高温菌数量分别占23.8%、23.1%、41.6%、43.5%和27.4%。因此，这些高温菌为北方大曲的优势菌属，另有魏斯氏菌属和丙酸菌。

2.2.3 江淮派大曲细菌群落结构分析

从属分类水平上，江淮地区大曲的主要微生物结构数量图见图6。结果表明，10号样品的优势菌为乳球菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属等，其中乳酸菌群数量占69.8%，芽孢杆菌属占20.8%；1号样品的优势菌为乳杆菌属、链孢子菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌和片球菌，其中乳酸菌数量占63.4%，其次为链孢子菌属，数量为22.6%。

图5 北方地区浓香型大曲细菌群落结构

图6 江淮地区浓香型大曲细菌群落结构

2.2.4 长江中游大曲细菌群落结构分析

长江中游地区大曲的主要微生物结构比例图见图7，如图7所示，优势菌为乳酸菌群。

图7 长江中游地区浓香型大曲细菌群落结构

3 总结

浓香型白酒发酵过程中的微生物和酶主要来源于大曲，而微生物群落分布和生长与地域、气候、环境条件等息息相关。本研究针对不同地区浓香型白酒大曲中微生物结构进行了系统的研究。综上结果表明，浓香型酒曲中原核类微生物种类占总体69%，数量占总数31%。浓香大曲中原核微生物主要为厚壁菌门，其中乳酸菌群为优势菌，部分样品还有高温嗜热菌、丙酸菌和Rheinheimera。