安琪清香型复合功能菌的应用技术研究

廖 蓓，李兆飞，常 煦，罗新杰，李志军

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443200）

我国白酒作为中国特有的传统酒种，是世界六大蒸馏酒之一，以其香型多样性、工艺特殊、香气、口感、风格独树一帜[1]。在我国传统酿酒工艺中，酒曲、酒醅和窖泥是酿造微生物的来源，直接影响到白酒的风格和品质。不同的微生物催化原料进行各种复杂的生化反应，分解淀粉、脂肪、蛋白质等，最终形成醇、醛、酮、酸、酯等白酒最重要的香气成分。这些复杂的微生物体系又受生长环境变化而改变代谢过程，因此酿酒的地域分布、环境和加工工艺成就不同的香型白酒。

近些年白酒酿造的基础研究都是以风味和健康因子为技术向导，研究白酒的风格化合物、特征风味化合物和功能微生物对风味影响等[2]，提出健康白酒应该通过“内寻外加，自然强化”来实现[3]。因此，我们寻求的白酒功能微生物是指在白酒酿造过程中，能促进白酒发酵或对白酒风味物质或白酒健康因子形成有益的微生物。在白酒的酿造过程中，不同香型的白酒其主体风味物质有很大的差别，因此筛选出具有优良性能的微生物并了解其特性，通过外加强化大曲和小曲，促进白酒发酵中风味物质的提高，从而增强主体香型，提高白酒的品质。

近年来在清香型白酒中的研究主要集中在高产酯类的菌种筛选和应用上。蔡学梅等[4]从酒曲中筛选出了高产乙酸乙酯酵母，扩大培养后制成酵母麸曲，并应用于中试车间发酵，发现添加功能酵母并不影响出酒率。张黎杰[5]通过基因重组构建高产乙酸酯酿酒酵母MY15，并应用于清香型大曲白酒生产中，结果显示，重组菌株和亲本菌株相比，具有高产乙酸乙酯低产高级醇的特点。除清香型大曲白酒外，小曲白酒也是我国白酒的主要酒种之一，年产量约占白酒总产量的30%，小曲酒由于原料不同、工艺不同，目前品种繁多、各有特色。除黄酒外，白酒包括米香型白酒、豉香型白酒和小曲清香型白酒三大类[6]。通过研究对小曲中微生物和发酵微生物的变化的分析，发现小曲微生物主要是酵母菌和霉菌，还存在一些细菌和放线菌[7]。王海燕等对清香型小曲酒的微生物进行分析鉴定，结果发现，其中的优势酵母菌有4种：扣囊复膜酵母、异常汉逊酵母、东方伊萨酵母、酿酒酵母；前3种是产酯酵母，而最后1种是产酒酵母；优势霉菌则是米根霉，主要起糖化作用[8]。由于它还能产生酯类、有机酸等一系列代谢产物，因此对酒体风味也有重要影响。李锐利[9]从酿酒小曲中分离筛选出1株高产乙酸乙酯酵母菌株，经鉴定是异常汉逊氏酵母，该酵母菌株在产酯培养基中，30℃下静置培养4 d，产乙酸乙酯量可达2.152 g/L。该菌株在清香型小曲酒的生产中进行应用，可提高清香型小曲酒的酒质。众多研究均表明，功能微生物对酒质的影响起关键的作用。

目前对清香型大曲和酿酒小曲中的微生物的研究主要集中在功能菌株的分离、筛选、鉴定、培养发酵条件优化方面，以及制曲过程中的变化规律。部分研究将单一菌种制成麸曲或菌液加入发酵过程中进行强化，但对复合型功能菌的应用较少。安琪酵母公司通过对不同单一功能微生物的研究，针对清香型酒对酒质提升的需求，开发一款清香型功能菌，主要应用于清香型大曲的强化和配合安琪酿酒曲在小曲酒的应用，能明显提升酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量，从而提高酒质。本研究针对安琪酵母公司开发的新清香型复合功能菌金香霸进行应用研究，包括应用方法和应用效果进行评价，通过优化应用方法而提高清香型小曲酒的质量。

1 材料与方法

1.1 材料

原料及耗材：普通南方大米，市场购买；酿酒曲、清香型功能菌香霸和金香霸（香霸和金香霸为两个不同配方的清香型功能菌产品）、耐高温型酿酒高活性干酵母为湖北安琪酵母公司产品；传统小曲，某酒厂提供；糖化酶，市场购买。

仪器设备：生化培养箱，上海一平仪器公司；气相色谱仪GC-7890A，安捷伦公司；色谱柱，白酒专用分析柱。

1.2 工艺过程

1.2.1 实验室酿造小曲酒工艺路线

工艺1：大米—浸泡—初蒸—复蒸—摊晾—拌曲（酿酒曲和金香霸）—加水后入桶密闭发酵—蒸馏—小曲酒。

工艺2：大米—浸泡—初蒸—复蒸—摊晾—拌曲（酿酒曲和金香霸）—培菌糖化—加水后入桶密闭发酵—蒸馏—小曲酒。

工艺3：大米—浸泡—初蒸—复蒸—摊晾—加入金香霸—培菌糖化24 h—加曲搅拌—加水后入桶密闭发酵—蒸馏—小曲酒。

工艺4：大米—浸泡—初蒸—复蒸—摊晾—加入高酒酵母和糖化酶—加曲搅拌—加水后入桶密闭发酵—蒸馏—小曲酒。

其中：酿酒曲用量为原料的0.5%，金香霸为0.2%，耐高温型酿酒高活性干酵母用量为0.2%，糖化酶用量为300 U/g，本地土曲用量为1.5%。

1.2.2 实验室酿造小曲酒操作过程

采用40～60℃水浸泡大米8～10 h，待蒸锅中水开后开始蒸米，大米铺3～5 cm厚，初蒸30 min，复蒸20 min，要求饭粒饱满，熟而不黏。摊晾后分装于不同小发酵桶，按照实验组下曲拌匀，培菌时间12～24 h，然后加入水进行密封发酵。如不培菌则直接加水进行密封发酵。发酵温度控制在30℃，发酵9 d左右，发酵结束蒸馏取酒，酒精度在40%vol左右。

1.2.3 小型工厂半固态法大米酿造小曲白酒工艺操作过程

选择大米含水量在13%以下，无霉烂。泡粮水温70℃左右，粮水比为1∶1.7，泡粮时间在3～8 h之间，大米增水量在40%左右，沥干进行初蒸。锅底水沸腾后大汽初蒸20 min，中间洒水淋饭复蒸约50 min至大米熟透心，含水量在55%～60%。提前将摊晾场地清洁、消毒、晾干，待粮蒸熟出甑摊平，用锹铲翻动均匀平整，待品温降至50℃左右时，再次翻动，等品温降至35～40℃时拌曲（对照组直接拌纯种根霉酒曲，实验组拌入金香霸）后开始做箱，做箱厚度在10～12 cm。根据室温，适当加盖保温物。保证温度不低于25℃。培菌时间24 h后出箱，将粮曲加入缸内同时加水130%，保持品温在30～35℃（此时实验组加入酿酒曲），搅拌均匀后封缸发酵，发酵时间12 d。发酵结束时取发酵醪液进行蒸馏取酒，去酒头1 kg，接酒酒精度在50%vol左右。

1.3 分析与检测

1.3.1 酒醅理化分析[10]

水分-恒温失重法；酸度-中和滴定法；还原糖、淀粉-斐林试剂法。

发酵醪液酒精度（%vol）为100 mL醪液加100 mL水蒸馏出100 mL后酒精度计测定的酒度值。

1.3.2 酒质分析[10]

总酸：滴定法；总酯：皂化滴定法。

1.3.3 风味成分

采用气相色谱法：取酒样降度至55%vol，进样气相色谱分析。载气及流速：氮气1.3 mL/min;气化室温度：250 ℃；进样量1 µL；分流比40∶1；尾吹：40 mL/min。检测器：FID，氢气流速：30 mL/min；空气流速400 mL/min。升温程序：起始柱温40℃保持5 min，以6℃/min升至52℃；再以12℃/min升至130℃，以25℃/min升至240℃，保持10 min，内标为4-甲基-2-戊酮。

2 结果与分析

2.1 金香霸配合酿酒曲采用不同发酵工艺对发酵的结果影响

2.1.1 金香霸配合酿酒曲采用不同发酵工艺理化指标结果比较（表1）

表1 金香霸配合酿酒曲不同的发酵工艺的理化指标

从表1可以看出，酿酒曲配合金香霸采用不同的工艺进行发酵，实验组2和实验组3采用培菌工艺总酸略有提升，总酯增加比较明显，酒精度略有降低。说明金香霸更适合培菌工艺，对酒的香气提升有很大帮助。从实验组2和实验组3的理化指标比较看，培菌的方法不同对酒的香气的影响也非常大，在实验组3中先采用金香霸培菌再添加酿酒曲发酵的总酯含量提高一倍多，发酵酒精度略有下降，说明发酵过程中酯化反应更多，乙醇与各类酸反应生成酯类，提高总酯含量。

2.1.2 金香霸配合酿酒曲采用不同发酵工艺风味分析结果比较（表2）

表2 金香霸配合酿酒曲采用不同发酵工艺风味分析结果 (mg/L)

从表2可以看出，实验组2采用加金香霸直接培菌与实验组1加金香霸不培菌相比，乙酸乙酯的含量从133.63 mg/L提高到245.21 mg/L，β-苯乙醇含量从59.51 mg/L提高到160.33 mg/L，另外丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙缩醛的含量均有提高，说明加酿酒曲配合金香霸培菌对酒的香气提升明显。对比试验组2和试验组3，采用不同的培菌方式条件下试验组3中金香霸单独培菌对香气提升的效果更加明显，乙酸乙酯含量提升3倍多，从245 mg/L提高到912 mg/L。乳酸乙酯含量从20 mg/L提升到46 mg/L，另外丁酸乙酯和乙缩醛含量均有所提升。由此推断，金香霸中的产香酵母在与酿酒酵母一起进行培菌时，产香能力受到明显的抑制，分析可能是由于酿酒酵母生长速度快于产香酵母，导致产香酵母繁殖细胞数降低，而影响产香能力。

2.1.3 金香霸配合酿酒曲采用不同发酵工艺综合性分析

从理化指标和风味指标综合来分析可以看出，酿酒曲配合金香霸采用不同的发酵工艺对最终酒的总酯和风味物质的含量影响明显。采用金香霸培菌工艺和不培菌工艺比较，培菌工艺会略微影响发酵酒精度，从而影响最终酒的产量，但是从风味指标上看，培菌工艺能够明显提高酒的风味物质而提高酒的品质。通过对比不同的培菌方法，发现采用金香霸单独培菌能明显提高酒的风味物质含量，特别是乙酸乙酯的含量。因此金香霸属于清香型功能菌，能明显提升清香型酒或清香型小曲酒中酯类物质的含量。

2.2 金香霸配合酿酒曲与其他酒曲相比对发酵结果的影响

通过实验明确了金香霸的最佳应用方法，我们收集了本地土曲对比酿酒曲和一些酒作坊常使用高酒酵母加糖化酶等添加不同的酒曲做对比进行了以下研究。发酵过程中香霸均采用先培菌后添加酒曲的工艺。

2.2.1 不同酒曲发酵的理化指标比较（表3）

从表3可以看出，4种酒曲中，酿酒曲的残淀粉、残还原糖最低，同时发酵酒精度最高。相对于高酒酵母加糖化酶进行发酵，酿酒曲的发酵酒精度、总酯含量更高，残淀粉含量和残糖含量更低，发酵特性具有明显优势。本地土曲相比酿酒曲和高酒酵母加糖化酶的总酯含量明显较高，为1.2 g/L，略低于金香霸加酿酒曲组的1.8 g/L。本地曲发酵酒精度在4组酒曲中最低，为9%vol，残淀粉和残还原糖最高，分别为2.12 g/L和1.5 g/L，说明土曲的发酵力较低，应用于生产的酒产量相对其他组会最少。金香霸加酿酒曲组总酯含量最高，为1.8 g/L，发酵酒精度高于土曲组，能达到10%vol。综合以上分析表明，酿酒曲出酒率最高，土曲最低；金香霸加酿酒曲组香味物质浓度最高，高酒酵母加糖化酶组最低。土曲的糖化力和发酵力均低于其他组。

2.2.2 不同曲发酵的风味物质分析结果比较（表4）

由表4可看出，高酒酵母加糖化酶组风味物质含量最低，酒的风味较差。酿酒曲的风味，土曲的各种酯含量均高于酿酒曲组和高酒酵母加糖化酶组；除己酸丙酯含量（29.96 mg/L）较高以外，所测的其他风味物质含量均低于金香霸加酿酒曲组。从数据上看金香霸加酿酒曲组的乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇含量分别为912.56 mg/L、9.48 mg/L、46.72 mg/L和70.94 mg/L，说明金香霸配合酿酒曲采用金香霸先培菌后加酿酒曲的发酵工艺生产的酒的风味物质较土曲好，出酒率较土曲更高，更适合应用在小曲白酒中。

表3 不同的酒曲发酵理化指标

表4 不同酒曲发酵的风味物质分析结果 (mg/L)

2.3 金香霸配合酿酒曲在小型酒厂中的应用

进行本实验的工厂小曲酒工艺过程中有糖化培菌24 h，在不改变工艺条件下，能加入金香霸培菌24 h，再加入酿酒曲和水进行发酵，实验结果见表5。

表5 金香霸配合酿酒曲在小曲酒生产中的应用结果

由表5可知，采用金香霸配合酿酒曲进行发酵，总酯含量为1.2 g/L、乙酸乙酯的含量为961.3 mg/L，乳酸乙酯含量为313.4 mg/L和β-苯乙醇含量为146 mg/L，都明显高于采用纯种根霉酒曲发酵组；总酸和杂醇油的含量两组基本相当，出酒率酿酒曲加金香霸组略高。说明金香霸的产香能力明显，再配合酿酒曲出酒率高的特点，在生产中在保证出酒率的条件下明显提升酒的香气物质，提高酒的优级品率。

3 结论和展望

清香型复合功能菌金香霸在发酵过程中能增加酒体的香气物质，但随着生产应用方法不同，产香能力也会有很大的差异。本试验通过研究其应用条件发现，金香霸在发酵过程单独进行培菌后再配合酿酒曲进行发酵能使其产香能力最大化。通过比较几种在目前清香型小曲酒的生产工艺中应用的酒曲，采用金香霸配合酿酒曲能集合产香和出酒率高两个优点，在保证出酒率的前提下明显提高乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量，其中乙酸乙酯含量提升最为明显。

白酒生产过程是多菌种作用发酵的复杂体系，目前白酒功能菌的研究大部分为白酒酒曲和发酵过程中重要的模式菌株的分离、筛选和鉴定，但对复合型功能微生物的应用研究较少。复合功能菌的特点是能够从多个维度去强化大曲，优化关键风味指标从而提高优级品率。目前我们的主要研究集中在多菌种复合对强化大曲的影响和提高小曲酒品质等等，包括复合功能菌的应用方法和代谢的特点。

随着白酒行业的发展，很多酒厂正在进行机械化改造，未来采用复合功能菌来弥补机械化过程中发酵微生物体系也显得尤为重要，因此未来需要在单一功能微生物的筛选和研究上进一步研究多微生物共体系发酵的特点，包括酶系变化、代谢产物、对酒香气变化，以及各微生物之间共生长的影响和在不同生产阶段过程的协调性等。