甘蔗渣生产白僵菌研究

冯玉元，何华

(1.玉溪市红塔山自然保护区管护局， 云南 玉溪 653100； 2.武汉生物工程学院，湖北 武汉 430415)

白僵菌Beauveriabassiana是一种以昆虫为寄主的病原真菌，可工业化培养生产，利用其产生的分生孢子加工成微生物杀虫剂，广泛应用于生物防治农林果蔬害虫，对人畜无毒无害，不污染环境，是保护环境的理想生物杀虫剂，值得推广应用[1]。目前大多选用麦麸作为生产原料，每克产品的含孢量越高，对害虫的感染致死率越高，杀虫效果越好；白僵菌既能虫生，又能腐生，具有二重生活习性，同时是一种好氧性生长真菌。在生产过程中，其对营养物质需求不苛刻，只要有一定的有机物和适量的氧气，均能正常生长发育。甘蔗渣是甘蔗Saccharumofficinarum榨取糖汁后的残渣余物[2]，比麦麸松散，颗粒之间的间隙大，空隙多，与麦麸混合，可使培养基形成优良通透性。作者在日常培养基中使用一定甘蔗渣用量代替麦麸，用麦麸甘蔗渣不同比例的培养基多次生产试验，结合麦麸、甘蔗渣的市场价格核算生产原料成本，筛选白僵菌的最佳生产、最经济生产和优化生产配方，以期变废为宝，降低生产成本，提高白僵菌产品质量。

1 材料与方法

1.1试验材料

仪器：电子天平(精确到0.001 g)，电磁炉，高温高压灭菌锅(126 ℃，0.14 mPa，一次可灭菌15 mm×150 mm试管4 000支)，解剖刀，接种针，温度计，湿度计，风干机，空调，水分测定仪等。

菌种培养基配料：蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，一级面粉5 g，黄豆粉5 g，普钙1 g，松毛虫粉5 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，琼脂20 g，水1000 mL。熬化配料，分装试管(15 mm×150 mm)和培养皿(100 mm)，灭菌制成斜面培养基、平面培养基[3]。

生产原料：麦麸和甘蔗渣。

1.2菌种制作

1.2.1纯菌种分离培养 可通过菌丝培养分离和孢子培养分离获得纯菌种。

菌丝培养分离菌种：从林间采集感染白僵菌的思茅松毛虫DendrolimuskikuchiiMatsumura幼虫体，在无菌接种箱内，浸入96%乙醇中，取出在酒精灯火焰上立即烧一下，用无菌刀解剖虫体成小块，大小以1 mm为宜，挑取3个虫体中部小块分开接种于平面培养基上。在20 ℃室内培养3 d，虫体小块四周可见白色菌丝，挑取分离虫体小块远端洁白粗壮菌丝，转接到斜面培养基上培养，这样反复挑取分离2～3次转接培养，可分离到纯菌丝。纯菌丝培养10～15 d，培养基上长满白色粉层即可作为菌种。

孢子培养分离菌种：在无菌接种箱内，取2个上述解剖的中部虫体小块，置于250 mL三角瓶内浸泡100 mL无菌水中并摇晃10 min，用吸管吸取虫体浸泡液，滴入平面培养基上，倾斜并旋转培养皿，使浸泡液均匀分布。在20 ℃室内培养2 d，可见培养基生长微小白色圆点，圆点生长成圆形菌落，至直径10 mm时，即可挑取菌落边缘菌丝，转接到斜面培养基上培养，可1次性分离到纯菌丝，培养基上长满白色粉层即可作为菌种。

1.2.2 菌种扩大培养 用一级面粉作培养基扩大培养白僵菌生产菌种[3]。

1.3 白僵菌产品生产 甘蔗渣晒干后粉碎即可，大小颗粒在1～2 mm为宜。日常生产白僵菌培养基为麦麸，在培养基中依次减少10%麦麸，依次加入等质量的甘蔗渣代替麦麸，直至100%甘蔗渣，成为甘蔗渣麦麸不同比例的10个培养基处理，以全麦麸培养基作对照处理(表1)。分别用35%清水置于搅拌机内，搅拌均匀，装入130 mm×170 mm带盖塑料培养瓶中，每瓶装料400 g左右。放入100 ℃常压灭菌室(一次灭菌培养料1.5 t，3 000瓶)保温灭菌3 h，趁热移到无菌接种室，冷却到25 ℃，每瓶接试管种1支，摇晃培养瓶，使菌种与培养料充分混合。放入20 ℃室内培养7～10 d，将料从瓶中倒出，置于通风的阴凉处晾干[3-4]。每个培养基处理做100瓶生产试验，每个处理做10次重复生产。

1.4 含孢量测定 测定白僵菌产品含水量在5%左右时，粉碎。取1 g样品菌粉，用无菌水稀释10 000倍，在清洁的血球计数板上加盖片，用吸管吸取稀释液从盖片侧面滴入稀释液，让稀释液缓缓渗入血球计数板内。置于15×40倍显微镜下，静止片刻，视野内计数板中流动孢子相对稳定后，用计数器逐格记录每小格内孢子数目。计数板内400小格容量为0.000 1 mL，因此可计算1 mL(即1 g)菌粉的孢子含量。1 g菌粉孢子数量是小格内孢子数目乘10 000倍，即1 g菌粉孢子数量=400小格内孢子数目×10 000。

1.5 原料成本计算 按照市场价格，麦麸2元/kg，甘蔗渣0.5元/kg。以生产1 000 kg白僵菌为单位，计算1 000 kg生产原料成本(元)=麦麸质量(kg)×2(元/kg)+甘蔗渣质量(kg)×0.5(元/kg)。

1.6 数据分析 将麦麸甘蔗渣不同用量比例培养基生产白僵菌产品含孢量原始数据导入Excel 2016软件处理，采用SPSS 17.0对试验数据进行单因素方差分析检验[5]。

2 结果与分析

日常生产白僵菌培养基是用麦麸作原料，产品含孢量大约为105亿个孢子/g。逐渐减少麦麸生产用量比例，相应增加甘蔗渣生产用量比例，白僵菌产品的含孢量随着甘蔗渣比例增加而逐渐上升；当麦麸和甘蔗渣生产用量比例各占50%时，产品含孢量达到最高；而后随着甘蔗渣生产用量比例增加，产品含孢量开始下降，生产培养基全部为甘蔗渣时，产品含孢量下降到85亿个孢子/g(表1)。

表1 麦麸甘蔗渣不同比例培养基生产白僵菌的含孢量和原料成本

注：LSD多重比较，同列不同大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)， 不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05)。

白僵菌产品含孢量单因素方差分析表明，不同比例甘蔗渣用量培养基对生产白僵菌产品的含孢量产生了显著影响。除20%麦麸+80%甘蔗渣处理与对照全麦麸处理(P=0.014)，40%麦麸+60%甘蔗渣处理与60%麦麸+40%甘蔗渣处理(P=0.011)，同时与70%麦麸+30%甘蔗渣处理(P=0.017)间含孢量差异没有达到极显著；其余处理间含孢量差异均达到极显著(F=276.269，Df=100)(表1)。结合麦麸、甘蔗渣的市场价格核算生产原料成本，得出白僵菌的最佳生产、最经济生产配方。

最佳生产配方：使用50%甘蔗渣代替麦麸生产白僵菌，与其他10个处理生产白僵菌比较，含孢量存在极显著差异水平，能最大幅度提高产品含孢量，同时能降低成本，生产1 000 kg白僵菌产品可以降低生产原料成本750元。

最经济生产配方：使用70%甘蔗渣代替麦麸生产白僵菌含孢量，与全麦麸生产白僵菌比较，每克产品只提高大约3亿个孢子，含孢量没有达到极显著差异水平，但能大幅度降低成本，生产1 000 kg产品可以降低生产原料成本1 050元。

3 结论与讨论

在日常生产白僵菌培养基麦麸中，使用一定比例的甘蔗渣替代麦麸作培养基生产白僵菌。因为甘蔗渣比麦麸松散，颗粒之间的间隙大，空隙多，与麦麸混合，可使培养基形成优良通透性，在培养基中存贮大量氧气，在养分和氧气充足状态下，菌丝生长旺盛，孢子梗发育完全，产孢子量大，所以用甘蔗渣代替麦麸可不同程度提高白僵菌产品的含孢量。

当甘蔗渣比例增加到50%代替麦麸时，可以充分满足菌丝生长、孢子梗发育和孢子形成的物质条件，产品含孢量达到最高值。之后，产品含孢量随着甘蔗渣用量比例增加而减小，甘蔗渣比例增加到一定程度时，虽然可以为菌丝生长、孢子梗发育和孢子形成的生理代谢提供充足氧气，但麦麸量的减少，必然导致营养成分不足，影响菌丝生长、孢子梗发育和孢子形成，因此产品含孢量随着甘蔗渣用量比例增加而减小。尤其是甘蔗渣用量比例增加至80%以上时，营养不足，含孢量显著下降，仅97.6亿个/g，达不到产品质量要求100亿个/g。完全用甘蔗渣，营养严重不足，含孢量低，仅为85亿个/g，白僵菌产品质量差。

当甘蔗渣与麦麸比例各占50%时，每克白僵菌产品的含孢量最高，生产原料成本显著下降，成为最佳生产配方。 当甘蔗渣占70%麦麸占30%时，每克白僵菌产品的含孢量有一定提高，而生产原料成本大幅度下降，成为最经济生产配方。

当甘蔗渣比例大于50%小于70%时，产品质量在最佳生产配方之下而在最经济生产配方之上，经济效益在最佳生产配方之上而在最经济生产配方之下，成为优化生产配方，既能提高产品的含孢量，又能降低生产成本，提高经济效益。优化生产配方应用于生产白僵菌产品，可以实现产品质量和经济效益最优化的相互统一。