基于肠肾轴理论探讨通腑泄浊方调节肠道菌群清除慢性肾脏病模型大鼠尿毒症毒素的机制❋

戴铭卉，孔 薇

(1. 南京中医药大学，南京 210001； 2. 南京中医药大学第三附属医院，南京 210001)

慢性肾脏病(CKD)在我国成人中发病比率高达10.8%[1]。随着Meijers等提出[2]“肠肾轴”概念，揭示肠道微生物的紊乱在CKD病情进展中扮演重要角色。CKD患者肠道动力下降,潴留的蛋白质被肠道致病菌酵解代谢成多种有毒物质[3-4],诱导CKD患者体内氧化应激反应，促进CKD的发展。

大黄是中医治疗CKD的代表药物。胡顺金[5]等发现，大黄泄浊颗粒灌肠能改善患者微炎症状态，减少肾小球硬化和肾间质纤维化的发生。大黄还可改善患者脂质代谢功能，调节钙磷代谢,减轻肾损伤[6-7]。通腑泄浊方(生大黄20 g，生槐花30 g，六月雪30 g，蒲公英30 g，生牡蛎30 g，附子10 g)是笔者继承中医肾脏病创始人邹云翔教授学术思想，根据《黄帝内经》中“开鬼门，洁净府，去菀陈莝”的理论为治疗原则，以大黄为君药，前期研究中发现其在降低慢性肾脏病3～5期患者肠源性尿毒症毒素、改善临床症状方面具有疗效。本实验旨在基于“肠肾轴”理论，从肠道生物屏障的角度入手，探讨通腑泄浊方对CKD大鼠肾功能保护、改善肠道菌群紊乱及炎症状态的情况，以期进一步探明其作用机制。

1 材料

1.1 药物与试剂

中药颗粒剂生大黄、生牡蛎、蒲公英、生槐米、六月雪、附子(江阴天江药业有限公司)；金水宝胶囊(江西济民可信有限公司)；硫酸吲哚酚标准品(美国Sigma公司)；腺嘌呤(美国AMRESCO公司)；双歧杆菌(Bifidobacterium longum,1.2186)购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心；大肠杆菌(Escherichiacoli,1.356)购自南京市中医院药剂室；E.Z.N.A®.Mag-Bind® Stool DNA Kit试剂盒(美国OMEGA公司); TGF-β1兔抗大鼠抗体(美国abcam公司); 兔超敏二步法免疫组化试剂盒、DAB 试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)；大鼠白介素-6ELISA试剂盒(上海西唐生物科技公司)；甲醇(山东瑞星化工有限公司)；乙腈(德国Merck公司)；三氟乙酸(济南瑞福化工有限公司)。

1.2 主要仪器

Waters515型高效液相色谱仪，配717型自动进样器、2475型荧光检测器(美国waters公司)；色谱柱：BDS HyPersil C18色谱柱(大连依利特)；实时定量PCR仪:ABI 7500；METTLER TOLEDO AL-204电子分析天平(梅特勒仪器上海有限公司) 。

2 方法

2.1 分组、模型复制与药物干预

清洁级雄性SD大鼠32只，6周龄，体质量(180±30)g，由南京中医药大学动物实验中心提供(动物许可证号SCXK(浙)2014-0001)。按随机数字表法分为空白对照组、模型组、通腑泄浊方组、金水宝组4组各8只，于温度、湿度恒定的动物房中适应性饲养1周。

从实验第 1 天开始，除空白对照组外其余各组大鼠每日上午灌服腺嘌呤剂量 200 mg/kg/d，至第4周结束。第4周末每组随机抽取2只大鼠，目内眦取血检测肌酐、尿素水平，提示造模成功[8]。从第5周开始除空白对照组外，其余各组大鼠隔日上午灌服腺嘌呤剂量200 mg/kg/d，至第7周结束。第8周开始各组均停止灌服腺嘌呤，整个实验过程所有大鼠进水及饮食均不受限制。

实验开始后第1天根据组别分别给予相应药物干预，根据徐叔云《药理实验方法学》[9]标准动物等效剂量法(K=0.018)及6种颗粒剂与生药材的换算比，给予通腑泄浊方颗粒剂(生大黄0.6 g·kg-1·d-1，附子0.15 g·kg-1·d-1，生槐花0.54 g·kg-1·d-1，六月雪0.09 g·kg-1·d-1，蒲公英0.36 g·kg-1·d-1，生牡蛎0.045 g·kg-1·d-1)灌胃，每日1次，连续8周。金水宝组给予中药灌胃治疗，按中国药典中6 g/d剂量给药，根据徐叔云《药理实验方法学》标准动物等效剂量法(K=0.018)，则虫草制剂按照0.54 g/kg/d剂量给予金水宝组大鼠灌胃，每日1次，连续8周。

模型组大鼠自实验开始的第1天，给予蒸馏水灌胃，每天1次，连续8周。

对照组大鼠自实验开始的第1天，给予蒸馏水灌胃每日2次至第4周末。自第5周开始，隔日上午给予蒸馏水灌胃，每天下午给予蒸馏水灌胃，至第7周末。第8周每天下午给予蒸馏水灌胃。

2.2 标本收集及观测方法

第8周末采集标本，提前禁食禁水12 h。0.3 ml ·100 g-110%水合氯醛腹腔注射麻醉，随后给予腹主动脉采血，保存于无肝素采血管中，静置 20 min，3000 r/min 离心 10 min 后送检; 采血结束后摘取肾脏矢状面剖开， 4% 中性甲醛固定24 h，制作病理切片，HE染色备用。

2.3 生化检测

大鼠尿素、肌酐、尿酸、胱抑素c、白介素-6委托南京中医药大学第三附属医院检验科检测。

2.4 硫酸吲哚酚检测

采用高效液相色谱-荧光分析法。 标准品储存液的制备: 甲醇溶解并定容硫酸吲哚酚钾盐对照品23.71 mg，配得硫酸吲哚酚浓度为800 μg/mL的贮备液，用乙腈稀释成最终浓度分别为80、40、20、10、5、0.5、0.1 μg/mL的贮备液备用。色谱条件:流动相: 磷酸二氢钠缓冲液(0.1%三氟乙酸,pH2.5)-乙腈(92∶8);流速: 1.0 mL/min; 柱温: 30 ℃; 样品温度: 6 ℃; 检测波长: λex=280 nm，λem=390 nm; 样品处理方法:3000 r /min,10 min分离血清，-20 ℃保存。小心吸取血清 100 μL 于干净试管中，加入300 μL 0.2%三氟乙酸-乙腈(10∶90)沉淀蛋白，漩涡混匀30 s后离心 (12000 r /min，8 min，4 ℃)，吸取上层清液 200 μL，微孔滤膜滤过后进行分析。

2.5 转化生长因子-β1(TGF-β1)检测

采用免疫组织化学检验及半定量分析法。肾脏组织 TGF-β1采用 SP 二步法: 二甲苯脱蜡水洗，微波炉高火修复15 min，3% 过氧化氢孵育10 min，滴加一抗[TGF-β1(1∶50)] 4 ℃ 过夜，DAB 显色。阴性对照为PBS替代一抗于每次染色。Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫组化方法：每组内每张切片连续挑选6个400倍视野进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性累积光密度值(IOD)。

2.6 肠道菌群检测

表1显示，采用Real-timePCR法，所有研究对象均给予直肠按摩法收集粪便于密闭灭菌的试管内,-80 ℃低温冰箱内保存。称取75 mg粪便用E.Z.N.A®.Mag-Bind® Stool DNA Kit(OMEGA)提取粪便细菌基因组DNA -20 ℃保存。

换算各标准品1 μL的拷贝数(长双歧杆菌1.46× 1011,大肠杆菌2.16× 1011),用于制作标准曲线。反应体系10 μL:2×UltraSYBRMixture5μL, 上下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 3 μL;反应条件:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性15 s,T1℃(双歧杆菌58 ℃、大肠杆菌60 ℃)退火20 s,68 ℃延伸30 s,T2℃(双歧杆菌85 ℃、大肠杆菌85.5 ℃)保持15 s读取定量荧光数据,共40个循环。每个样品均同时做3个平行复孔。

表1 引物序列

2.7 肾脏病理形态学检测

肾小管间质纤维化指数(tubule interstitial fibros is index,TIFI)，TIFI根据纤维化程度分为4级(0～3级)。具体评分方法如下(20倍目镜下)：10级：表示无明显小管间质病变；21级：表示病变程度小于25%；32级：即灶状损伤，病变程度25%～75%；43级：即多灶状损伤，代表病变程度大于75%，说明分值由低到高，提示肾小管间质纤维化由轻到重。以上分析均由未知分组的南京中医药大学第三附属医院病理科完成。TIFI=[(1×X1+2×X2+3×X3)/10](X表示病变肾小管间质视野数)。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 实验大鼠一般情况

空白对照组大鼠动作敏捷，无脱毛，体质量增长正常，尿量正常，色淡黄，大便成形偏硬，饮水饮食正常，实验过程中死亡1只； 模型组大鼠渐出现精神萎靡，反应迟钝，活动迟缓，皮毛无光泽，毛量偏少，食欲差，饮水量多，尿量多，大便稀，体质量增长缓慢。实验过程中死亡2只；金水宝组整体状况与模型组比较有改善，实验过程死亡2只；通腑泄浊方组在毛色、精神状态、活动性、体质量方面较模型组明显改善，实验过程中死亡2只。

3.2 肠道菌群、炎症因子及肾小管间质纤维化指标

表2显示，与空白对照组比较，模型组粪便中大肠杆菌含量明显升高，双歧杆菌含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，通腑泄浊方组粪便中大肠杆菌含量明显降低，双歧杆菌含量明显升高(P<0.05)，IL-6、TGF-β1含量明显降低 (P<0.05)， TIFI明显降低 (P<0.05)；与金水宝组比较，通腑泄浊方组粪便中大肠杆菌含量明显降低(P<0.05)， 双歧杆菌含量明显升高(P<0.05)，TIFI明显降低 (P<0.05)，IL-6、TGF-β1 含量无明显差异。

表2 通腑泄浊方对慢性肾衰竭大鼠双歧杆菌、大肠杆菌、炎症因子及肾小管间质纤维化的影响

3.3 尿毒症毒素指标

表3显示，与空白对照组比较，模型组血清尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，通腑泄浊方组尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C、硫酸吲哚酚含量明显降低(P<0.05)；与金水宝组比较，通腑泄浊方组尿酸、胱抑素C含量明显降低(P<0.05)，硫酸吲哚酚含量无明显差异。

表3 通腑泄浊方对慢性肾衰竭大鼠尿素、肌酐、尿酸及胱抑素C及硫酸吲哚酚的影响

4 讨论

肠道不仅消化食物和吸收营养，肠道屏障还能防止肠腔内的有害物质，如细菌和内毒素穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环。生物屏障是肠道屏障最主要的组成，肠道生理性菌群则是生物屏障最重要的组成部分。大量研究提示，肠道菌群与慢性肾脏病关系密切。慢性肾脏病患者肠道微生物发生了显著变化，肠道中近200种微生物水平明显失衡，且细菌总数与肾损害程度正相关，出现大量的机会致病菌，共生益生菌群含量下降，机体免疫功能减弱，肠道屏障功能受损，大量含氮代谢毒素及内毒素进入循环，促进相关炎症反应的发生与发展，最终肾功能损害因此进展。本研究表明，CKD大鼠肠道双歧杆菌属菌落较空白对照组大鼠明显减少，大肠杆菌属菌落明显增多，造成这种结果的原因可能与慢性肾脏病大鼠肠道动力下降、肠道内益生菌肠道黏附力减弱、定植力异常、蛋白质及氨基酸在肠道潴留、肠道内含氮物质增多有关。这种肠道微生物环境紊乱可能导致“保护性”和“有害性”菌群之间的失调,从而促进炎症反应[10]。双歧杆菌占肠道益生菌总量的85%以上，近年研究显示CKD大鼠给予双歧杆菌和乳酸杆菌喂饲后，肠道黏膜的通透性改善，提示上述2种益生菌能够修复CKD大鼠肠道黏膜的损伤。本实验发现，通腑泄浊方能够明显增加CKD大鼠肠道内双歧杆菌含量，降低大肠杆菌含量。结合肾脏生化检测发现，通腑泄浊方可改善CKD大鼠肾损伤相关指标。通腑泄浊方组较模型组硫酸吲哚酚含量有明显差异，提示通腑泄浊方可降低大鼠血清中硫酸吲哚酚含量。表明通腑泄浊方对此类常规肾替代疗法难以改善的蛋白结合型尿毒症毒素的清除具有一定优势，体现了标本并治的原则，达到了延缓肾损害进展的目的。同时观察肾脏组织病理学发现，通腑泄浊方能够进一步减少肾脏纤维化，金水宝虽也有相同作用，但效果不如通腑泄浊方明显。

Ritz等[11]提出“肠肾综合征”概念，指出肠道微生物失调、肠道屏障功能障碍和细菌易位是造成血液透析患者系统炎症状态的重要原因。研究表明，微炎症状态存在于近半数终末期肾脏疾病(ESRD)患者中，这是其心脑血管疾病的主要致病因素，且与营养不良、贫血及高死亡率存在密切关系[12-14]。慢性肾脏病患者肠道动力减弱，肠道屏障损伤，使得被大量增加的大肠杆菌等革兰氏阴性菌酵解产生的含氮代谢物及内毒素入血，细菌移位，加速慢性肾衰患者微炎症状态的发生发展。本研究发现，模型组大鼠血清IL-6水平较空白对照组明显升高，证实CKD大鼠存在微炎症状态。通腑泄浊方组大鼠血清IL-6与模型组具有显著差异，可明显改善CKD大鼠的炎症状态。

转化生长因子-β1(TGF-β1)在CKD发生发展进程中起重要作用, 可通过调节基质金属蛋白酶(MMPs)的表达和活性等多种途径引起细胞外基质积聚,抑制细胞外基质降解，导致肾间质纤维化，加重肾脏损伤,是目前所知作用最强的促纤维化因子[15]。本实验显示，模型组大鼠肾脏组织中TGF-β1过度表达，肾脏间质纤维化严重。通腑泄浊方组大鼠肾脏组织中TGF-β1表达减少，肾脏纤维化现象较模型组减轻，表明通腑泄浊方具有减少肾组织中TGF-β1表达的作用。

人工培育虫草菌丝体研制而成的金水宝胶囊广泛用于慢性肾衰临床治疗，并有良好的疗效。金水宝胶囊能一定程度降低尿毒症代谢毒素，改善炎症状态，延缓肾损伤发生。但并不能通过调节肠道菌群紊乱，进而有效抑制CKD的发生发展。

本方紧扣“浊毒”病机,结合传统方义和现代药理，以大黄为君药共襄清热泄浊利湿之举。大黄是清热泻下的要药，现代药理研究发现，大黄能通过改变游离氨基酸在血浆中的含量，达到降低血氨及肝脏荷尔蒙生成的目的；机体氮质的再利用率也可因大黄增强谷氨酰胺合成酶的活性而提高；大黄可下调残肾代谢率，保存肾单位，控制肌蛋白的分解，增加肌酐和尿素的排泄。同时，牡蛎有收敛固涩的功效，附子能促进血尿素氮的排泄、改善电解质紊乱，槐花清热凉血，蒲公英、六月雪清热解毒利湿，6药合用，附子燥热得制，大黄无泻下过度之虞。采用中药颗粒剂使用方便，吸收率高。本研究显示，通腑泄浊方可通过调节CKD模型大鼠肠道菌群，减轻氧化应激，改善炎症状态，减轻肾脏间质纤维化，延缓CKD病程发展。