新疆四大优势产区葡萄酒中生物胺含量的测定

王 瑞，许超丽，乔 丹，李 倩，张 轲，张珍珍*

（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

新疆是我国第一大葡萄产区，其丰富的光热资源有利于优质葡萄的生长[1]。新疆的葡萄酒产业近几年发展迅猛，目前已经形成了伊犁河谷、天山北麓、吐哈盆地及焉耆盆地四大优势产区[2]。随着葡萄酒产业发展及食品安全问题的出现，我国对葡萄酒中生物胺的关注也不断提高。生物胺是氨基酸脱羧或醛类物由氨基酸转氨酶转氨作用形成的，其广泛存在于发酵食品中[3]。生物胺属于葡萄酒中的不良代谢产物，有研究认为它会引起头痛、心悸等过敏性反应，生物胺在人体细胞中会被某些酶代谢降解，但酒精和乙醛会抑制这些酶的活性，使得脱毒效率减小[4-7]。其中，组胺和酪胺被认为是对人体危害最大的生物胺，部分国家已经对葡萄酒中组胺含量作出了限定标准，例如：澳大利亚、瑞士限量范围为≤10 mg/L，比利时≤5～6 mg/L，法国为≤8 mg/L[8-9]，而我国目前仍未对葡萄酒中组胺含量作出限量标准。研究认为，葡萄酒中的生物胺主要是组胺、酪胺和腐胺，微生物还原利用以及其他的化学还原反应均能降低生物胺的含量[10-12]。目前，生物胺的检测方法也多种多样，主要有生物传感器（biosensor）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）、薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）以及高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC）法等[13-15]，其中HPLC因其检测灵敏度高、柱效高、检测分析速度快等原因成为葡萄酒中生物胺检测最常用的方法之一。

本研究采用高效液相色谱法对新疆四大优势产区60个葡萄酒样品中的生物胺总含量及8种生物胺（色胺、苯乙胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺）组分含量进行检测，分析比较不同品种及产区葡萄酒中生物胺总含量及其中8种生物胺含量的差异，对新疆葡萄酒中生物胺含量的安全控制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新疆天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四大产区60个葡萄酒样品：市售。葡萄酒样品类型及编号见表1。

表1 葡萄酒样品类型及编号Table 1 Types and number of wine samples

1.1.2 试剂

丙酮、甲醇、色胺、苯乙胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、丹磺酰氯（均为色谱纯）：美国Sigma公司；氯化钠、乙醚、氯仿、正丁醇（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

1200Series高效液相色谱仪：美国Agilent公司；CT-6020A酸度计：深圳市柯迪达电子有限公司；PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；D2155W离心机：美国Sigma公司；HS120210漩涡仪：美国HeathrowVortexer公司；0.22 μm孔径有机相滤膜：上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

向10mL的葡萄酒样品中添加NaCl至饱和，待样品饱和后，取上清液5mL于离心管中，调节pH值为12.0，加入5 mL正丁醇-氯仿溶液（正丁醇∶氯仿=1∶1，V/V）振荡萃取5 min，在3 600 r/min的条件下离心10 min，吸取上层清液。重复萃取过程2次后，移取3mL萃取液于10mL试管中，加入0.3 mL HCl（1 mol/L），振荡混合后，氮气（N2）吹干，加入1 mL HCl（0.1 mol/L）溶解，样品待衍生。

1.3.2 生物胺标准溶液的配制

采用HCl（0.1 mol/L）分别将8种生物胺（色胺、苯乙胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺）标准品溶解，配制成质量浓度均为100 mg/L的标准贮备液，并保存于4℃。分别取8种生物胺的标准贮备液1 mL置于10 mL的容量瓶中，用HCl（0.1 mol/L）定容，配制成生物胺混合标准溶液。最后分别移取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL上述标准储备液于10 mL容量瓶中，并用HCl（0.1 mol/L）定容，配制成质量浓度分别为1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的标准溶液。

1.3.3 标准品及样品的衍生

生物胺分子本身没有紫外或者荧光吸收，必须通过衍生化的方法来使得生物胺可以被紫外或荧光检测器检测到，而丹磺酰氯是近几年较为常用的氨基酸荧光衍生试剂之一，丹磺酰氯与生物胺反应，能够形成具有很强荧光的单酞化衍生物，从而使生物胺能够被检测到。

标准品的衍生：取上述生物胺标准溶液0.5 mL，向其加入1 mL丹磺酰氯，1.5 mL饱和碳酸氢钠，60℃下避光反应30min后，再加入100μL谷氨酸钠溶液混合均匀，60℃条件下反应15 min。反应结束后，各加入1 mL超纯水，混匀，40℃条件下氮气吹去丙酮。然后加入乙醚3 mL进行萃取，并重复萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃条件下氮气吹干后，用1 mL色谱纯甲醇进行溶解，过0.22 μm滤膜，滤液待测。

样品的衍生：同标准溶液的衍生方法。

1.3.4 生物胺含量的检测

采用高效液相色谱法检测葡萄酒中的生物胺含量。

色谱条件：流动相A为甲醇，B为超纯水，梯度洗脱，C18色谱柱（150 mm×4.6 nm，5 μm），进样量20 μL，柱温30℃，流速：1.5 mL/min，检测波长254 nm，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

定性分析：在相同的色谱条件下，对照8种生物胺标准品HPLC色谱图出峰时间，对样品中各生物胺进行定性分析。

定量分析：通过HPLC色谱检测葡萄酒样品中各生物胺的峰面积，根据8种生物胺标准曲线回归方程，计算葡萄酒样品中各生物胺的含量。

2 结果与分析

2.1 新疆四大产区葡萄酒中生物胺总量的测定

葡萄酒样品中各生物胺组分高效液相色谱图如图1所示。新疆四大产区葡萄酒中生物胺总含量的测定结果见图2。

图1 葡萄酒样品不同生物胺组分检测的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of different kinds of biogenic amines in wine samples

图2 新疆四大产区葡萄酒样品中生物胺的总含量Fig.2 Total contents of biogenic amines in wine samples from four major production areas in Xinjiang

由图1可知，葡萄酒样品中生物胺组分在35 min内分离效果较好，葡萄酒样品中各生物胺出峰时间顺序为：色胺（4.51 min）、苯乙胺（14.56 min）、腐胺（17.87min）、尸胺（20.53 min）、组胺（22.92 min）、酪胺（25.39 min）、亚精胺（27.62 min）、精胺（28.36 min）。

由图2可知，新疆葡萄酒中生物胺含量在9.15～226.13 mg/L范围内波动。新疆四大产区各葡萄酒中生物胺含量有所不同，其中天山北麓产区葡萄酒样品中生物胺总含量在10.28～130.57 mg/L，伊犁河谷产区生物胺总含量在49.93～64.67 mg/L，焉耆盆地产区生物胺总含量在9.66～168.60 mg/L，吐哈盆地产区生物胺总含量在9.66～226.13 mg/L。其中，伊犁河谷产区的葡萄酒样品中生物胺含量较其他三个产区含量相对较少，各样品中生物胺总含量均＜64.67 mg/L，57号吐哈盆地的赤霞珠干红含量较高，达到了226.13 mg/L。而在同一产区中，不同酿酒品种葡萄酒中生物胺含量也不同，如天山北麓产区中14号黑比诺干红生物胺总含量为13.59 mg/L，而赤霞珠干红最高达到172.17 mg/L。吐哈盆地产区酒样虽同为赤霞珠干红，但各样品中生物胺含量也不相同，说明葡萄酒中生物胺的生成是一个复杂的过程，葡萄酒酿造所选酿酒原料、辅料及葡萄酒生产工艺以及后期贮藏条件等都有可能对葡萄酒中生物胺含量造成一定的影响[16-17]。

2.2 新疆四大产区葡萄酒中生物胺组分含量测定

分别对新疆四大产区葡萄酒中的精胺、亚精胺、组胺、色胺、酪胺、苯乙胺、腐胺及尸胺8种生物胺的含量进行检测，结果如图3所示。

由图3可知，除个别酒样中酪胺和亚精胺未检出外，其余样品中组胺、酪胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺均检出。天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地及吐哈盆地四大产区60个葡萄酒样品中8种生物胺的含量均存在一定的差异。其中，精胺相对于其余7种生物胺含量较高，54号吐哈盆地产区的赤霞珠干红含量最高，为154.60 mg/L，而40号焉耆盆地产区的霞多丽干白含量最低，仅为0.90mg/L；苯乙胺含量较少，在0.33～4.50 mg/L范围内；组胺是所有生物胺中对人体危害较大的一种[18-19]，经检测，各产区葡萄酒样品中组胺含量均≤15.34 mg/L，其中焉耆产区的31号赤霞珠干红酒样中组胺含量最高，为15.34 mg/L，其它各葡萄酒样品中组胺含量均在0.64～12.17 mg/L之间，60个葡萄酒样品中的腐胺和尸胺含量相对平稳，其余6种生物胺含量在各样品中差异较大。同时可以看出，同一产区中不同品种酿造的各葡萄酒样品中生物胺含量也有所区别，说明生物胺含量与酿酒原料也有一定关系。而同一产区中的赤霞珠干红中的生物胺含量的差异有可能与不同酒庄酿造工艺与卫生环境有关。

图3 新疆四大产区葡萄酒样品中8种生物胺组分的含量Fig.3 Contents of eight kinds of biogenic amines components in wine samples from four major production areas in Xinjiang

3 结论

本研究采用高效液相色谱法，对新疆天山北麓、吐哈盆地、焉耆盆地及伊犁河谷四大优势产区60个酒样中的生物胺总含量及8种生物胺含量进行检测分析。不同产区中生物胺总含量有所差异，其中天山北麓产区葡萄酒样品中生物胺总含量在10.28～130.57 mg/L，焉耆盆地产区生物胺总含量在49.93～64.67 mg/L，吐哈盆地产区生物胺总含量在9.66～168.60mg/L，伊犁河谷产区生物胺总含量在9.66～226.13mg/L。而同一产区中的不同的葡萄酒样品中生物胺含量也有所不同，如6号和9号样品虽同为天山北麓产区的赤霞珠干红，但其组胺含量相差11.44 mg/L。各产区葡萄酒中，精胺所占比重较大，含量在0.90～154.60 mg/L范围内；苯乙胺含量较低，在0.33～4.50 mg/L范围内；组胺含量均＜15.34 mg/L；腐胺和尸胺含量相对平稳，其余6种生物胺含量在各样品中差异较大。