甘肃部分酒类产品中氨基甲酸乙酯污染状况调查

王慧娟，孙建云，马文杰*

（甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730020）

酒精饮料（葡萄酒、白酒、黄酒等）作为传统发酵工业中的一个重要分支，在为人类提供大量消费产品的同时也存在着一些潜在的危险因素，其中伴随发酵过程而产生的氨基甲酸乙酯正越来越多的引起人们的注意[1]。氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一种发酵过程产生的天然副产物，是一种水溶性致癌物质，可引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等[2]。2007年国际癌症研究机构对氨基甲酸乙酯（EC）进行了评估，将其修订为2A类致癌物，即为可能的人类致癌物。随着我国人均收入水平的提高和生活方式的改变，我国居民酒精饮料消费量日趋上升，EC对人体健康风险问题应该引起我国公共卫生的关注[3]。北美法规规定了不同饮料中所含氨基甲酸乙酯的数量及水平，世界各国逐渐重视了对其的研究工作。加拿大1985年设定了各类酒中的限量标准，其中佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超过30 μg/L，美国食品和药品管理局（food and drug administration，FDA）规定1988年以后生产的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%vol）中氨基甲酸乙酯含量≤15 μg/L，日本清酒规定其含量≤100 μg/L，由于受到多方面限制，我国含酒精饮料中（包括黄酒、葡萄酒、白酒、啤酒）均尚未制定氨基甲酸乙酯限量标准[4-8]。目前，酒精饮料中氨基甲酸乙酯的检测主要有气相色谱质谱（gas chromatography，GC）法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）荧光检测器法[9]。样品的前处理方法有液液萃取、固液萃取、固相萃取和固相微萃取[10-11]。本研究旨在通过对2010年到2013年采集部分酒类产品中氨基甲酸乙酯的气质联用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）监测结果进行分析，对我省的酒类产品中氨基甲酸乙酯的本底污染状况有了一个初步的的调查和了解，为广大人民群众健康饮酒提供指导数据，为风险评估和相关标准的制定提供了基础数据，对于寻求如何科学有效的降低酒中氨基甲酸乙酯的潜在含量的控制措施，提升品质，加强我省酒类产业的发展和升级提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒（37份）、白酒（65份）、葡萄酒（50份）样品，共计152份：甘肃省14个地、州、市市售。

无水硫酸钠：国药集团化学试剂公司；乙酸乙酯、乙醚、甲醇等（均为色谱纯）：美国默克公司；氨基甲酸乙酯标准品和内标（D5-氨基甲酸乙酯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱质谱联用仪、CLE-硅藻土固相萃相柱：美国Agilent公司；MX-F旋涡混合器：美国SCILOGEX公司；N-EVAP氮吹仪：美国Organomation公司；Visiprep SPE固相萃取仪：美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

称取2.0 g样品，加100 μL D5-氨基甲酸乙酯内标使用液，于旋涡混匀器上混匀，置于硅藻土固相萃取柱上，抽真空，让样液慢慢渗入柱中，静置约10 min，用10 mL 5%乙酸乙酯/乙醚洗脱并收集于10 mL离心管中，洗脱液于30℃用氮气（N2）缓缓吹干，用1 mL甲醇溶解移至样品瓶中供GC-MS分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为DB-INNOWAX弹性石英毛细管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度200℃，载气流速1.0mL/min，不分流进样，进样量1 μL；柱温程序：初温50 ℃、保持1 min，然后以10℃/min升至200℃。

质谱条件：电子电离源（electronic ionization，EI）温度230℃；电子能量70 eV；接口温度220℃；采用选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式；溶剂延迟：4 min。氨基甲酸乙酯特征离子：44、62、89，定量离子62：D5-氨基甲酸乙酯特征离子：44、64、76，定量离子64，内标法定量。

1.3.3 氨基甲酸乙酯标准曲线的绘制

准确移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL0.2μg/mL的氨基甲酸乙酯标准储备液，加100 μL 1.0 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，用甲醇定容至1.0 mL，得到质量浓度分别为20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/mL的标准使用液（含100.0 ng/mL D5-氨基甲酸乙酯），进行仪器分析，绘制氨基甲酸乙酯标准曲线。

1.3.4 方法的加标回收率及精密度试验

称取2.0 g样品（可溶性固形物含量为30%～40%），分别添加50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL三个浓度水平的氨基甲酸乙酯标准溶液，以加标回收率试验来验证方法的可靠性；每个水平至少测定6组样品，以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来验证方法的精密度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

EC、D5-EC标准品总离子流色谱图见图1。

图1 EC、D5-EC标准品总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of EC and D5-EC standards

由图1可知，氨基甲酸乙酯（EC）的出峰时间为13.16min，D5-氨基甲酸乙酯（D5-EC）的出峰时间为13.09min。

按照1.3.3的方法，配制标准曲线，以氨基甲酸乙酯与内标D5-氨基甲酸乙酯浓度比（X）为横坐标，相对应的峰面积比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。

图2 氨基甲酸乙酯标准曲线Fig.2 Standard curve of ethyl carbamate

由图2可知，EC标准品在20～160 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=1；标准曲线回归方程为Y=0.479X+0.040 8。

2.2 方法的加标回收率及精密度试验结果

按照1.3.4的方法进行了加标回收率试验和精密度试验，每个浓度水平进行6次平行测定，结果如表1所示。

表1 氨基甲酸乙酯加标回收率及精密度试验结果（n=6）Table 1 Results of adding standard recovery rate and precision degree of ethyl carbamate(n=6)

由表1可知，氨基甲酸乙酯在3水平上添加回收率范围为81.5%～93.0%，平均回收率为84.55%～90.93%，符合色谱分析回收率80%～120%的要求，说明方法适用。3个水平测定结果的RSD为1.94%～2.84%，均＜3%，说明方法的精密度良好，能保证测定结果的准确性和可靠性。当试样取2.0 g时，以信噪比（S/N）为3时对应的含量作为方法的检出限（limit of detection，LOD），将标准溶液稀释进样，得到本方法氨基甲酸乙酯含量的检出限为1.0 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。

2.3 样品检出情况

按照1.3.1的方法对所有样品进行了分析测定，不同酒类氨基甲酸乙酯检出情况见表2，氨基甲酸乙酯检出样品的污染水平见表3。

表2 不同酒类氨基甲酸乙酯检出情况Table 2 Detection of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

表3 不同酒类氨基甲酸乙酯检出样品中污染水平Table 3 Contamination levels of ethyl carbamate in different alcoholic drinks

由表2、表3可知，所有样本的总体检出率为70%，其中黄酒37份，检出28份，检出率为75%，污染水平为2.99～77.59 μg/kg；白酒65份，检出30份，检出率46%，污染水平为8.31～203.39 μg/kg；葡萄酒50份，检出49份，检出率为98%，污染水平为1.92～25.81 μg/kg。三种酒类中白酒的检出率最低，样本检出数据跨度最大，而且单个样本的最高值出现在白酒中，为203.39μg/kg；葡萄酒的检出率最高，但样本检测数据的跨度最小，单个样本的最小值也出现在葡萄酒中，为1.92 μg/kg。

2.4 甘肃省酒类产品中氨基甲酸乙酯与全国水平对比

全国食品污染物监测网新增酒类中EC监测结果与甘肃省酒类样品中氨基甲酸乙酯污染水平比较见图3。

通过图3对比发现，全国三种酒类EC的污染水平的状况为黄酒最高（116μg/kg），白酒居中（50.0μg/kg），葡萄酒最低（20.5μg/kg）；甘肃省的平均数据为白酒最高（34.93μg/kg），黄酒居中（20.24 μg/kg），葡萄酒最低（9.88 μg/kg）。甘肃省的污染水平与全国的污染水平存在一定差异，主要表现为黄酒和葡萄酒的平均水平偏低，白酒的检出率偏低。通过深入分析和总结，核对样本信息后发现，造成差异的原因可能是：黄酒在甘肃省的酒类消费比例中所占比重较小，品牌也比较单一，所采集到的样品多为含黄酒的料酒等；葡萄酒存在同样的情况，样本中甜型或半甜型葡萄酒所占比重较大，干红等发酵酒所占比例较低，所以整体数值偏低；白酒样本的品质较低，对部分样本走访调查发现整体价格不高，推断其中的勾兑酒可能较多，因此检出率偏低，从白酒的样本信息还发现所检测的白酒中氨基甲酸乙酯含量，酒精度越高，储存时间越长的白酒，氨基甲酸乙酯的含量也越高。本研究是依托国家化学污染物监测网展开的，采样方式是委托市级兄弟单位进行采样，由于在样品采集过程中，只对样品采集地类型和采样方式进行了规定，没有对样品的类型进行细致规定，使得研究结果与全国水平存在差异，只能代表甘肃部分酒类产品中氨基甲酸乙酯的污染状况。

图3 甘肃省与全国酒类氨基甲酸乙酯污染水平对比Fig.3 Comparison of contamination levels of ethyl carbamate in Gansu province and China

3 结论

用固相萃取结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）法对酒类产品中的氨基甲酸乙酯进行检测，该方法的加标回收率为84.55%～90.93%，相对标准偏差（RSD）＜3%，方法的精密度和准确度良好。对甘肃省152份酒类样品样品的测定结果显示，EC检出率为70%，其中白酒最高，其次为黄酒，葡萄酒最低，含量分别为34.93μg/kg、20.24μg/kg、9.88μg/kg。甘肃地处西北，经济发展水平相对落后，消费水平偏低，下一步结合膳食结构的调查可以对该类污染物进行有效的预测、预警及风险性评估，为更加全面的分析甘肃省酒类产品中氨基甲酸乙酯污染水平提供了基础和思路。同时研究结果对于我国酒精饮料中EC的限量标准的制定提供一定的基础数据，对于我国生产的酒精饮料的竞争性及安全性[12-15]具有积极的意义。