响应面法优化百香果果醋发酵工艺及质量分析

康 超，杨玉霞，冯 珍，帅 良1，，罗杨合1，，段振华，伍淑婕*

（1.贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899；2.贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542899；3.广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地，广西 贺州 542899；4.大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034）

百香果（Passiflora edulis）学名西番莲，又称巴西果、鸡蛋果，是西番莲科多年生木质藤本植物果实的通称，因其香气浓郁，可散发出菠萝、香蕉等多种水果香味，故得名百香果[1-2]。它是世界上已知最香的水果之一，被国内外誉为“果汁之王”[3-4]。研究表明，百香果富含天然活性成分类黄酮，其是减除烦躁和缓减压力的基本元素，能生津止渴，提神醒脑，食用后能增进食欲，促进消化腺分泌，有助消化[5-6]。果实中含有多种维生素，能降低血脂，防治动脉硬化，降低血压，其果汁需求量在国际市场上呈供不应求的趋势[7-9]。

果醋具有丰富的营养价值，富含有机酸、多种氨基酸、矿物质、维生素及生物活性物，有效维持体内的酸碱平衡，能刺激大脑神经中枢，提高人体的消化吸收，提高肝脏的解毒机能，调节血液循环系统，提高人体免疫力的功效[10-11]，具有抗氧化活性等功能[12-13]。按用途分类，果醋可分为调味型和饮料型果醋，调味型果醋一般酸度＞3.5%，饮料型果醋酸度＞0.3%，但≤1.5%。饮料型果醋可由调味型果醋稀释调配而成[14-15]。

百香果鲜果具有水分含量高，不耐长久储运等缺点，而被用于鲜食。百香果的深加工不仅能提供各种高附加值的产品，而且还能带动整个百香果产业的发展[16]。果醋以其良好的储藏性与灵活的使用性，深受广大消费者的喜爱，是果蔬产品开发的主要途径之一，主要是作为复合型果蔬饮料进行研究[17-19]，百香果果醋发酵工艺及质量等研究较少[20-23]。本研究主要采用单因素试验考察醋酸菌接种量、温度、初始酒精度、转速对液态发酵百香果果醋的影响，应用析因试验、响应面试验优化百香果醋发酵工艺参数，并对其质量进行分析。以期为广西特色水果百香果的资源利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料酒

原料酒：以前期试验最优发酵条件下得到的百香果果酒作为发酵原料酒，酒精度为10.7%vol，可溶性物含量为5.6%。

1.1.2 菌种

巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）AS 1.41：广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.3 试剂

酵母膏、葡萄糖、琼脂粉、无水乙醇、氢氧化钠、牛肉膏等（均为国产分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂公司；果胶酶（10 000 U/g）、纤维素酶（100 FBG/g）：诺维信生物技术有限公司。

1.1.4 培养基

斜面培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，CaCO31.5%，酒精2%（灭菌冷却至50～60℃后加入），琼脂2%。

种子液培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，酒精2%（灭菌冷却至50～60℃后加入）。

以上培养基均在0.1 MPa、121℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

ZWYR-D2403恒温振荡摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；BSA124S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SQ510C高压蒸汽灭菌锅：重庆雅马拓科技有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；DL-CJ-2N超净台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；UV1901PC紫外可见分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；BX53显微镜：日本奥林巴斯有限公司；Fe20-K pH计：美国METTLER TOLEDO集团公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果果醋发酵工艺流程及操作要点

操作要点：

（1）百香果果汁的制备[24]：百香果洗净、切开、破碎、酶解（果胶酶、纤维素酶），获得百香果果汁。

（2）酒精发酵[25]：（已灭酶）获得的百香果果汁为原料，接入酵母种子液进行酒精发酵，其中最优工艺条件为酵母接种量0.05%、初始糖度21.8%、发酵时间6d、发酵温度29℃，得到百香果果酒。

（3）醋酸发酵：以过滤后的百香果果酒为原料，调整初始酒精度为4%vol～9%vol，醋酸菌接种量4%～12%（V/V），转速90～210 r/min，温度26～34℃，进行醋酸发酵，获得百香果果醋液。

（4）过滤：将百香果果醋液过滤后，得到澄清的百香果果醋溶液。

（5）调配、杀菌、灌装。

1.3.2 百香果果醋发酵工艺优化单因素试验

巴氏醋酸菌的活化：将保存在4℃环境下的安瓿管取出，用脱脂棉（体积分数为75%的酒精浸泡）擦拭安瓿管，将其尖端放在火焰上加热，滴少量无菌水至加热处使之破裂，用镊子轻轻敲开，取出小管内的脱脂棉，将管口处在火焰上灼烧片刻，呈悬浮状，即成菌液。吸取0.5 mL菌液划线接种到2根斜面培养基，在30℃的温度下培养48 h，经过2次继代培养后，备用。菌种可在2～8℃环境下保存3个月。

种子液的制备：用接种环将斜面培养基上的巴氏醋酸菌刮入含有200 mL种子液体培养基的500 mL三角瓶中，四层纱布封口，置于30℃恒温振荡箱中培养48 h，检测其巴氏醋酸菌总数，约达5.7×106CFU/mL。

单因素试验：以巴氏醋酸菌接种量10%（V/V）、初始酒精度7%vol、发酵温度32℃、转速150 r/min，糖度5.6%为基本条件，以总酸含量作为评价指标，采用单因素轮换法，选取百香果果醋发酵工艺中巴氏醋酸菌接种量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）、原料酒初始酒精度（4%vol、5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、发酵温度（26 ℃、28℃、30 ℃、32℃、34 ℃）、发酵转速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）进行单因素试验，用四层纱布封口，每隔24 h测定总酸含量，考察4个因素对百香果果醋发酵的影响。

1.3.3 百香果果醋发酵工艺优化析因试验

析因试验是一种科学有效试验方法，可以对多因素多水平交叉分组进行分析检验显著因子。在前期单因素试验的基础上，结合相关文献报道[26-28]，本试验设计N=16的析因试验，以总酸含量（Y）为评价指标，考察巴氏醋酸菌接种量（A）、发酵温度（B）、转速（C）、发酵时间（D）4个因素对百香果果醋发酵时产酸效果的影响，每个因素取2个水平：低水平用“-1”表示，高水平用“+1”表示，析因试验设计见表1。

表1 百香果果醋发酵工艺优化析因试验设计Table 1 Design of the factorial experiments forPassiflora edulis vinegar fermentation technology optimization

1.3.4 百香果果醋发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验和析因试验的基础上，以总酸含量（Y）为评价指标，采用Box-Behnken法设计试验，对析因试验筛选出的显著因子巴氏醋酸菌接种量（X1）、转速（X2）和发酵时间（X3）进行响应面试验，响应面试验设计因素与水平见表2。

表2 百香果果醋发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology experiments forPassiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

1.3.5 测定方法

总酸的测定[29]：参考国标GB/T 12456—2010《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定。

醋酸菌总数[30]：参考国标GB 4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法检测。

根据国标GB/T 18187—2000《酿造食醋》标准中的检测方法，检测百香果醋中的不挥发酸、可溶性无盐固形物、游离矿酸、黄曲霉毒素B1、铅、砷、菌落总数、大肠菌群、致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）[31]。

1.3.6 数据分析

使用Microsoftofficeexcel2012、Origin8.5、SPSSStatistics和Design-Expert.8.05进行数据处理、图表制作及数据分析。

2 结果与分析

2.1 百香果果醋发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 巴氏醋酸菌接种量对百香果果醋中总酸含量的影响

不同的巴氏醋酸菌接种量对百香果醋总酸含量的影响结果见图1。

图1 不同巴氏醋酸菌接种量对百香果果醋总酸含量的影响Fig.1 Effects of different amounts ofA.pasteurianuson total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由图1可知，接种量直接影响醋酸发酵的原料转化速率和周期，接种量过小或过大都不利于醋酸发酵的进行。接种量为4%和6%时，发酵前4 d，醋酸菌代谢产酸不明显（约0.7 g/100 mL），第5天后才迅速产酸，分别发酵第9天和第11天后，总酸含量基本保持稳定（3.7 g/100 mL），最终总酸含量偏低（最高值约3.9 g/100 mL），这可能是由于菌体量少，发酵不充分，产酸能力较弱；当接种量为14%时，产酸曲线呈先上升后逐渐下降的趋势，产酸效果不理想（最高值约2.5 g/100 mL），这是因为接种量过大，菌体生长繁殖消耗过多的营养物质，导致代谢产酸量低，发酵后期，由于菌体老化，出现逐渐下降的趋势；当接种量为12%时，发酵前期产酸迅速（总酸含量变化为0～4.7 g/100 mL），发酵第6天后，发酵产酸基本结束，总酸含量稳定（4.7g/100mL）；当接种量为8%和10%时，发酵的产酸曲线趋势相同，发酵到11d时，达到最高值，均超过5.1g/100mL。整体来看，百香果果醋发酵巴氏醋酸菌最优接种量为8%。

2.1.2 初始酒精度对百香果果醋中总酸含量的影响

巴氏醋酸菌发酵的主要营养物质是酒精，酒精度越高产酸量越高，但是酒精浓度过高时会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸量下降，发酵周期延长。不同初始酒精度对发酵过程中巴氏醋酸菌产酸的影响结果见图2。

图2 不同初始酒精度对百香果果醋中总酸含量的影响Fig.2 Effects of different initial alcohol contents on total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由图2可知，不同的初始酒精度，产酸量和发酵周期也不同，初始酒精度为4%vol、5%vol时，总酸含量低（仅约为2.8 g/100 mL），发酵周期短，分别发酵到5 d、7 d，产酸结束，由于酒精度偏低，醋酸菌能在短期内快速消耗酒精产酸，但是产酸量仅为2.8g/100mL；当酒精度为8%vol时，产酸曲线呈“S”型，发酵前5d，发酵缓慢，产酸量在1.0g/100mL以下，直至第9天，总酸含量不增加，最终产酸量仅为2.7g/100mL，这说明8%vol的酒精度对醋酸发酵有抑制作用；当酒精度为6%vol、7%vol时，虽然醋酸发酵周期长，但最终总酸含量明显提高（均在4 g/100 mL以上），说明醋酸发酵较适合的初始酒精度范围为6%vol～7%vol，为了使百香果醋得到较高的酸度，所以选取初始酒精度为7%vol。

2.1.3 发酵温度对百香果果醋中总酸含量的影响

醋酸菌的生长温度为25～35℃，温度直接影响到醋酸菌的生长繁殖速度和产酸速度，适合的温度有利于菌体生长和目的产物的生成[32-34]。不同发酵温度对发酵过程产酸的影响结果见图3。

图3 不同发酵温度对百香果果醋中总酸含量的影响Fig.3 Effects of different fermentation temperature on total acid contents inPassiflora edulisvinegar

由图3可知，发酵前7 d，各处理组的醋酸发酵正常，产酸量相差不大（约3.5 g/100 mL），发酵7 d以后，当温度在26～32℃范围时，随着温度的提高，发酵过程中的产酸量提高（达到4 g/100 mL以上）；34℃处理组的总酸含量低于其他组别，分析原因可能是发酵后期，温度偏高，醋酸菌提前老化，故产酸量开始逐渐降低；当发酵温度为32℃时，发酵10d后，醋酸发酵基本结束，总酸含量较高（5.1g/100mL）；当发酵温度为30℃时，醋酸发酵至12 d，总酸含量最高（5.2 g/100 mL）。因此，百香果果醋发酵最优温度为30℃。

2.1.4 转速对百香果果醋中总酸含量的影响

醋酸菌是好氧微生物，当氧气充足时，菌体生长代谢旺盛，缺氧会抑制发酵的进行[32-33]。不同的转速对发酵液供氧量则不同，不同转速对发酵过程产酸的影响结果见图4。

图4 不同转速对百香果果醋中总酸含量的影响Fig.4 Effects of different rational speed on total acid contents in Passiflora edulisvinegar

由图4可知，当转速为180 r/min时，最终产酸量较高（5.3 g/100 mL）；当转速为210 r/min时，发酵前5 d，其产酸量均高于其他条件，5d后，发酵产酸速率变慢，10 d后，总酸出现下降趋势，最终总酸含量也不高（4.5 g/100 mL），分析原因可能是发酵前期由于充足的氧气供应使得醋酸菌大量繁殖代谢，总酸迅速增加，但是发酵后期，由于乙醇和醋酸挥发或者水分的蒸发[28]，对醋酸发酵有不利的影响。综上所述，转速为150～180r/min，较有利于百香果发酵。

2.2 百香果果醋发酵工艺优化析因试验结果

固定酒精度7%vol，采用析因试验考察巴氏醋酸菌接种量（A）、发酵温度（B）、转速（C）、发酵时间（D）对醋酸发酵的影响，以总酸含量（Y）为评价指标，试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 百香果果醋发酵工艺优化析因试验结果Table 3 Results of factorial experiments forPassiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

表4 百香果果醋发酵工艺优化析因试验方差分析结果Table 4 Variance analysis results of factorial experiments for Passiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

由表4可知，发酵转速、发酵时间对醋酸发酵影响极显著（P＜0.01），巴氏醋酸菌接种量影响显著（P＜0.05），发酵温度影响不显著（P＞0.05），因此，确定主要影响醋酸发酵的因素是转速、发酵时间和巴氏醋杆菌接种量，并选用这3个因素进行响应面试验，固定最优发酵温度为30℃，进一步确定最优发酵条件及各因素间的交互作用。

2.3 百香果果醋发酵工艺优化响应面试验结果

2.3.1 模型的建立和显著性的验证

以总酸含量（Y）为评价指标，选取巴氏醋杆菌接种量（X1）、转速（X2）和发酵时间（X3）3个影响显著的因素，采用Box-Behnken对百香果醋发酵工艺条件进行响应面优化试验，试验设计与结果见表5，回归模型方差分析结果见表6。

表5 百香果果醋发酵工艺优化响应面试验设计与结果Table 5 Design and results of response surface experiments for Passiflora edulisvinegar fermentation technology optimization

采用Design-Expert.8.05软件对响应面试验结果进行多元回归拟合分析，得到的二次回归拟合方程：

由表6可知，该模型极显著（P=0.000 8），模型失拟项不显著（P=0.3812＞0.05），说明所得模拟合性较好。方程的决定系数R2为0.952 7，调整决定系数R2adj为0.891 8，信噪比为12.250，远大于4，说明预测值与试验值有较好的相关性，试验误差较小。因此可用此模型分析和预测百香果果醋的发酵工艺条件。从回归方程模型系数的显著性检验可知，模型的一次项X2、X3、交互项X2X3和二次项X22影响极显著（P＜0.01），一次项X1、交互项X1X3及二次项X32影响显著（P＜0.05），交互项X1X2及二次项X12影响不显著（P＞0.05）。根据F值大小可知各因素影响醋酸发酵的主次顺序为：发酵转速（X2）＞巴氏醋酸菌接种量（X1）＞发酵时间（X3）。

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 响应面结果分析与验证

巴氏醋酸菌接种量、转速和发酵时间各因素两两交互对百香果醋发酵的影响结果如图5所示。

图5 接种量、转速和发酵时间交互作用对百香果果醋总酸含量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,rational speed and fermentation time on total acid content inPassiflora edulisvinegar

由图5可知，该结果与单因素试验结果一致，随着因素水平值的增大，总酸含量呈先逐渐增大后保持稳定的趋势，同时各因素的显著性与析因试验结果一致。由Design-Expert.8.05软件综合分析处理得到百香果果醋发酵工艺的最佳发酵条件为：初始酒精度7%vol、发酵温度30℃、巴氏醋酸菌接种量11.10%、发酵转速166.34 r/min、发酵时间10.01 d。在此优化条件下，百香果醋中总酸含量的理论值为5.42 g/100 mL。为了检验模型的准确性及实用性，将工艺参数修正为：初始酒精度7%vol、发酵温度30℃、巴氏醋酸菌接种量11%、转速166 r/min、发酵时间10 d，在此条件下，百香果醋中总酸含量为5.37 g/100 mL，与最优条件下的理论值（5.42 g/100 mL）接近。

2.4 百香果醋质量评价

按照国标GB/T18187—2000《酿造食醋》要求，对百香果醋的理化、卫生指标进行检测评定，结果如下：总酸（以乙酸计）含量为5.3g/100mL；可溶性无盐固形物含量为2.3g/100mL；菌落总数为5 CFU/mL；大肠菌群为0 MPN/100 g；游离矿酸、砷（以As计）、铅（以Pb计）、黄曲霉毒素B1、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌均未检出，果醋理化指标及卫生指标均符合国家相关标准。

3 结论

本研究通过单因素试验、析因试验和Box-Behnken设计试验，得出百香果果醋发酵工艺的最优条件为：巴氏醋酸菌接种量11%、发酵温度30℃、初始酒精度7%vol、转速166 r/min、发酵时间10 d。在此优化条件下，百香果果醋总酸含量为5.37 g/100 mL。经质量评价得出该百香果果醋质量符合国家标准GB/T 18187—2000《酿造食醋》要求，说明经响应面分析方法优化获得的工艺参数是可信的，对后期的工业化生产具有较好的参考价值。