HPLC法同时测定清香类酒醅中主要酸和酯类物质

魏志阳，李秋志，邢 爽，郭凯凯，谌柄旭，王孟祺，郭学武，肖冬光*

（1.天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.河北山庄老酒股份有限公司，河北 承德 067500；3.天津酿源生物科技发展有限公司，天津 300457）

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，其多种天然微生物混合固态发酵及固态甑桶蒸馏的独特生产工艺，形成以低级脂肪酸和乙酸酯为主体香味成分的风格特点[1-2]。白酒中风味成分可分为酸、酯、醇、醛和其他五大类[3]，其中酸酯含量占总风味物质的60%～80%，是白酒中最主要的呈香呈味物质[4-5]。

清香类型白酒包括大曲清香型、小曲清香型、麸曲清香型、老白干香型、米香型、凤香型等，其主要有机酸为乳酸和乙酸，主要酯为乙酸乙酯和乳酸乙酯[6-7]。清香类白酒具有清香纯正，醇甜柔和，自然协调，余味爽净的风格[8]，深受国内外消费者喜爱，且具有发酵周期短、原料出酒率高等特点[9]，其产量占中国白酒总量的25%左右。

目前，清香类白酒酒醅中主要酸、酯的检测是对发酵酒醅液态蒸馏后酒样进行分析[10-11]，其中乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸主要采用气相色谱（gaschromatography，GC）法[12-13]，乳酸和乙酸采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-18]，主要存在两方面的问题：一是在蒸馏过程中，由于乳酸乙酯挥发性差、沸点较高，使得酒醅中乳酸乙酯不能完全蒸馏到酒样中，因此气相色谱数据不能准确反映发酵酒醅中乳酸乙酯的含量；二是在对清香类白酒酒醅中四种主要物质进行分析时，需同时利用气相色谱和液相色谱，存在操作繁琐、分析时间较长等缺点[19]。迄今为止，白酒中酯类物质的检测方法还有高效液相色谱法[20-21]，洪薇等[22]采用气相色谱法测定白酒中的乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯和甲醇、正丙醇、β-苯乙醇8种物质，而用高效液相色谱法同时测定酒醅中酸类、酯类的方法仍鲜见报道[23]。本研究通过对高效液相色谱条件和酒醅中酸、酯提取条件的优化，建立了高效液相色谱法同时测定清香类白酒酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯的方法，旨在提高酒醅检测中乳酸乙酯的准确性，为清香类白酒发酵酒醅的分析与检测提供可靠方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒醅：分别取自清香型、老白干香型和米香型白酒厂；乳酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸、乙酸标准品（纯度均＞99.9%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent1260-HPLC-UV高效液相色谱仪：美国Agilent公司；FA2204B电子天平：上海精密仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准混合液配制

分别准确量取0.1 mL 4种物质的标准品，用体积分数为20%乙醇色谱溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得一定浓度混合母液。分别量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL标准混合母液用去离子水稀释、定容于10mL容量瓶，得到8.0～650.0mg/L之间不同浓度的混合标准液，备用。

1.3.2 流动相的配制

准确称取6.80 g磷酸二氢钾用去离子水溶解、定容于1000mL容量瓶，并用H3PO4调节pH至2.5，再经0.45μm水相滤膜过滤、超声脱气30 min后使用；色谱级乙腈经0.22 μm有机滤膜过滤、超声脱气30 min后使用。

1.3.3 高效液相色谱分析条件

COSMOSIL-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL；检测波长：210 nm。

1.3.4 酒醅处理

准确称取50.00g发酵酒醅于500mL烧杯中，加入300mL体积分数为10%乙醇搅匀。在室温下浸泡30 min（此期间每隔10 min搅拌一次），过滤；滤渣再用体积分数为10%乙醇溶液经反复清洗后，过滤、定容于500 mL容量瓶得到液相检测样品，备用。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法检测方法的建立

2.1.1 高效流动相及流速的选择

采用乙腈-水、乙腈-0.05mol/LKH2PO4等不同流动相组合进行试验，发现利用乙腈∶水（20∶80，V/V）作流动相时，各组分之间不能得到很好的分离，且峰型较差，高效液相色谱图见图1。而用乙腈-0.05 mol/LKH2PO4（8∶92，V/V）（pH=3.9）作为流动相时，乳酸乙酯和乙酸乙酯的峰型较好，但乳酸和乙酸的分离效果不太理想，高效液相色谱图见图2。这往往和缓冲溶液的pH有关，因为当有机酸（乳酸、乙酸）存在于pH大于其解离平衡常数（pKa）的水相溶液中时，容易发生解离，不能以单一的一种形式存在，故出现色谱峰重叠、分离效果差等现象。通过利用H3PO4调节缓冲液pH值后，发现当pH=2.5时四种物质都有着很好的分离效果且峰型较好，且满足一般C18色谱柱流动相pH值在2～9之间的要求，高效液相色谱图见图3。而在不同流速（1.2 mL/min、1.0 mL/min、0.8 mL/min）下分离4种物质效果的试验中，发现随着流速的增加，保留时间大幅缩短，但是分离度降低。综合考虑，最终确定最佳流动相配比为乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）（pH=2.5），流速为1.0 mL/min。

图1 乙腈∶水(80∶20)为流动相标准溶液高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶water(80∶20)as the mobile phase

图2 乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 3.9)为流动相标准溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 3.9)as mobile phase

图3 乙腈∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 2.5)为流动相标准溶液高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of standard solution using acetonitrile∶0.05 mol/L KH2PO4(8∶92,pH 2.5)as mobile phase

2.1.2 线性回归分析

取方法1.3.1中配制的混合标准溶液，在上述1.3.3色谱条件下进样，以峰面积（Y）为纵坐标，化合物质量浓度（X，mg/L）为横坐标，绘制4种物质的标准曲线，得到4种物质的标准曲线方程、保留时间、线性范围和检出限，结果见表1。由表1可知，其中4种物质的相关系数R2均＞0.999，表明二者有着良好的线性关系。4种物质的检出限在5.632～10.656 mg/L之间，可满足分析检测要求。

表1 4种标准品保留时间、回归方程和检出限Table 1 Retention time,regression equation and detection limit of the four standard substances

2.1.3 方法回收率试验

取方法1.3.1配制的已知浓度的混合标准样品，向其中添加一定量不同浓度的乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯标准溶液后混匀，进样分别测定其中各物质浓度，考察方法的回收率，结果见表2。由表2可知，4种物质的平均回收率都在96.1%～103.6%之间，相对标准偏差（relative standaral deviation，RSD）值均≤2.01%，说明该检测方法准确性好。

表2 4种物质的回收率试验结果（n=3）Table 2 Results of recovery rate tests of the four substances(n=3)

2.1.4 方法精密度试验

将方法1.3.1配制的混合标准样品，按上述1.3.3色谱条件连续进样6次检测4种物质含量，6次平行试验结果见表3。由表3可知，4种物质含量检测结果的RSD值均在0.43%～2.42%之间，符合定量检测要求，说明该方法测定结果精密度良好。

表3 四种物质测定的相对标准偏差（n=6）Table 3 Relative standard deviation of the four substances(n=6)mg/L

2.2 酒醅处理方法的确定

2.2.1 不同浓度乙醇对酒醅中四种物质提取效果的影响

准确称取4份酒醅各50.00 g，分别用蒸馏水、体积分数为5%、10%、15%乙醇作为溶剂，按照1.3.4所述方法处理得到酒醅浸提液。经0.22 μm滤膜后按方法1.3.3进样色谱分析，分别测定水及不同乙醇体积分数条件下4种物质含量，结果见图4。

图4 不同乙醇浓度下4种物质的含量测定结果Fig.4 Determination results of the four substances contents in different ethanol concentrations

由图4可知，乙醇体积分数对乳酸、乙酸的含量变化没有太大的影响，主要是由于二者均能与水、乙醇互溶；而乳酸乙酯和乙酸乙酯都较易溶于乙醇，所以随着乙醇体积分数的增加两者含量也逐渐增加，但当乙醇体积分数在10%以上时其含量变化幅度较小。综合考虑4种物质含量可知，在乙醇体积分数为10%时，4种物质的含量基本达到最大值，故选取体积分数为10%乙醇溶液进行样品酒醅的处理。

2.2.2 不同处理时间对酒醅中四种物质提取效果的影响

准确称取5份酒醅各50.00 g，按照方法1.3.4对酒醅分别处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min制得待测样品。按方法1.3.3进样色谱分析，观察不同处理时间下4种物质含量的变化，结果见图5。

图5 不同处理时间下4种物质的含量测定结果Fig.5 Determination results of four kinds of substances contents in different treatment time

由图5可知，随着处理时间的延长，4种物质的含量都随之增加，但提升幅度逐渐减小，且在30 min时均达到最大含量，说明此时酒醅中4种物质均已基本完全溶出，故选择室温下浸泡酒醅30 min。

2.2.3 酒醅样品检测及加标试验

准确称量50.00 g清香型酒醅，按方法1.3.4处理后得到待测样品，依1.3.3色谱条件进样检测，样品色谱图如图6所示；再准确称取两份相同的酒醅，其中一份添加与酒醅中初始含量大致相等的4种物质标准品，另一份添加大约相当于酒醅中初始含量一半的4种物质标准品，按1.3.4方法处理后进样测定4种物质含量，测定结果见表4。

图6 清香型酒醅样品高效液相色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of the fermented grains of light-flavor Baijiu

由表4可知，该方法测定清香型酒醅中4种物质的回收率均在93.2%～104.9%之间，RSD均低于2.27%，具有一定的可靠性。且其分析时间得到大大缩短，极大提高工作效率，适用于清香类酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯的定量检测。

表4 清香型酒醅样品测定及加标试验结果Table 4 Determination results of the light-flavor fermented grains and adding standard recoveries

2.2.4 不同清香类酒醅中四种物质的测定

对传统清香型、老白干香型和米香型酒醅中4种物质进行定量分析，结果见表5。由表5可知，传统清香型和老白干香型酒醅中乳酸、乙酸的含量差别较小，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量差别较大，其中老白干香型酒醅中乳酸乙酯含量约为传统清香型酒醅中的2.6倍，而传统清香型酒醅中乙酸乙酯含量约为老白干香型酒醅中的1.6倍；与其他两种香型相比，米香型酒醅中4种物质含量均为最低（乳酸898.80mg/100g、乙酸143.62mg/100g、乳酸乙酯30.97mg/100g、乙酸乙酯15.16 mg/100 g）。

表5 不同清香类白洒酒醅中四种物质含量测定结果Table 5 Determination results of four substances contents in different fermented grains of light-flavorBaijiu mg/100 g

3 结论

本试验建立了高效液相色谱法同时测定清香类酒醅中乳酸、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量的方法，方法学验证结果表明，精密度试验结果相对标准偏差RSD＜2.5%，加标回收率为96.1%～103.6%，说明该方法具有较高的精密度和准确性，可用于清香类白酒生产及发酵过程的监测。

通常利用气相色谱法对发酵酒醅蒸馏后酒样进行乳酸乙酯检测的方法，由于乳酸乙酯沸点高（154℃）、水溶性较强的特点以及酒醅酸度和酒度对其馏出率的影响，使酒样中乳酸乙酯的测定结果只有酒醅原含量的65%～75%，存在较大的误差。而本研究利用体积分数10%乙醇对酒醅中四种物质进行提取并经高效液相色谱进样分析后，可准确测定酒醅中乳酸乙酯含量，大大缩小测量误差。

对3种不同清香类酒醅中的4种物质进行测定，结果表明不同香型酒醅中4种物质含量存在一定差距，其中米香型酒醅中4种物质含量均最低，老白干香型的乳酸、乙酸和乳酸乙酯含量最高，传统清香型的乙酸乙酯含量最高。