不同时期摘叶对马瑟兰花色苷的影响

王安妮，肖慧琳，张超杰，郑秋玲，王 婷，唐美玲*

（山东省烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500）

马瑟兰是法国利用赤霞珠和歌海娜杂交育成的品种，近年来在烟台产区表现良好，长势中庸，果穗松散，颜色较好，抗病性强，栽培面积逐年增加。如何进一步提高其果实品质酿出具有产区特色的葡萄酒是目前急需解决的生产问题。

花色苷是酿酒葡萄与葡萄酒中至关重要的一类物质。葡萄果实和葡萄酒呈现出的颜色主要是由花色苷组分和含量决定，而颜色是评价葡萄果实和葡萄酒品质的一项重要依据[1]。葡萄品种中含有的花色苷组分主要由遗传因素决定[2]，但目前也有研究表明，环境因素和管理方式也会影响花色苷的组分和含量[3-6]。近年来国内外对于果际微气候调控对酿酒葡萄果实花色苷的影响开展了很多研究。大多数的酿酒葡萄适宜摘叶的时期是快速着色期，但不同品种和不同产区之间也有些许差异。LEMUT M S等[7]在维帕瓦谷测定的黑比诺表示在坐果期摘叶处理最佳。雷玉娟等[8]在新疆地区采用不同时期结合不同摘叶的方式处理赤霞珠，表明转色后半摘叶和采收前全摘叶均提高了果实含糖量，有利于花色苷的合成；张国涛等[9]在香格里拉分五个时期对赤霞珠进行摘叶处理，表示在转色前期及中期效果较好。

为进一步明确果际微气候调控对烟台产区马瑟兰果实中花色苷的影响，本研究拟通过转色期前、后两个时期对果穗周围叶片进行摘叶处理，探究马瑟兰果实中花色苷组分和含量的变化，为提高烟台产区马瑟兰品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试品种为马瑟兰980，均采自于山东省烟台产区蓬莱龙湖酒庄。

花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷：Miragen公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱（high efficiencyliquid chromatography，HPLC）仪：安捷伦科技有限公司；BSA224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；AA-56311有机相过滤器：安捷伦科技有限公司；H13237型超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；IKA MS3 basic涡旋振荡器：艾卡仪器设备有限公司；Centrifuge 5430R高速离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 试验设计

本次试验选择生长健壮，长势一致的植株，每10棵树为一个处理，重复3次，各处理随机排列。分别在转色前（花后35 d）和全部转色结束后（花后65 d）两个时期在果穗上下各摘除1片叶，不摘叶做对照。

1.3.2 果皮花色苷的提取

果实成熟时每个处理随机取样100粒浆果，样品采集后放入冰盒带回实验室剥取果皮放入液氮中速冻，然后用研钵磨成粉末放入真空冷冻干燥机-40℃下冷冻干燥24 h，果皮粉保存在-40℃冰箱内备用。准确称量0.2 g放入研钵，加入1.5 mL的提取液（甲酸∶水∶甲醇=2∶28∶70）继续研磨至无明显颗粒状，并用移液枪吸取1 mL于离心管中。室温下1500r/min避光摇床振荡10min，然后4℃条件下13000r/min低温离心10 min，取上清液经0.22 μm的滤膜过滤并收集到离心管内。-80℃保存待测上机。

1.3.3 果皮花色苷的定性和定量

花色苷采用高效液相色谱技术测定。色谱条件如下：KromasilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0mL/mim；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长525 nm；流动相A甲酸∶水=1∶9，B甲酸∶乙腈=1∶9。

采用外标法进行定性和定量分析。准确称取花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷这5种标准品用10%的甲酸溶液配制成质量浓度为10mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的标准液，经0.22 μm滤膜过滤后，在确定的色谱条件下上机测定，拟合5种花色苷的质量浓度（Y）和峰面积（X），得到标准曲线方程进行定量分析。相关系数均在0.999 2以上，线性关系良好，符合高效液相色谱的标准。其他各类酰化花色苷参考梁振昌的[10]测定结果推断色谱峰代表成分。

2 结果与分析

2.1 花色苷组分和相对含量对比分析

如表1所示，转色后摘叶处理组中检测出的数量与对照组相同，而转色前摘叶处理组中共检测出16种花色苷单体。除了对照组中的那12种葡萄糖苷花色苷之外，还多检测出2种单葡萄糖苷花色苷单体和2种双葡萄糖苷花色苷。虽然大多数研究结果表明欧亚种葡萄中只含有单葡萄糖苷花色苷，但也有少数研究表明，一些欧亚种中也存在少量双糖苷[11-14]，其在葡萄酒中的颜色和稳定性具有双重特性。在新酒中，双糖苷花色苷在热和光下的稳定性好于花色素单糖苷，但在葡萄酒的成熟和陈酿过程中是非常不稳定的[15-16]。至于本研究中转色前摘叶增加果实中的双糖苷花色苷对于后期葡萄酒呈色的影响有待于进一步研究。

表1 三种处理马瑟兰葡萄皮中花色苷的分析Table 1 Analysis of anthocyanins in grape skins of Marselan with three types of treatments

烟台产区马瑟兰果实中花色苷种类主要是五类，包括花翠素类、花青素类、甲基花翠素类、甲基花青素类和二甲基花翠素类，没有检测到花葵素类。其中相对含量最高的就是二甲基花翠素类，相对含量最低的是花青素类，这与多个研究结果一致[17-19]，摘叶处理没有改变这个趋势。三个处理对照组中二甲基花翠素类相对含量最高为92.06%，转色前摘叶组的相对含量最低为87.51%；花青素类相对含量最低的是对照组为0.36%，而转色前摘叶处理的相对含量最高为0.57%。转色前摘叶处理组中除了二甲基花翠素类相对含量低于对照和转色后摘叶的，其余四大类相对含量都要高于对照和转色后摘叶的。转色后摘叶的除了花翠素和二甲基花翠素类相对含量略低于对照组，其他三类相对含量高于对照组。

烟台产区马瑟兰果实中的花色苷以未酰化、香豆酰化、咖啡酰化和乙酰化四种形态存在。转色前摘叶组相对含量的高低顺序为香豆酰化花色苷＞未酰化花色苷＞乙酰化花色苷＞咖啡酰化花色苷。转色后摘叶处理与对照基本相似，只是相对含量比对照稍高，为45.68%。但转色前摘叶处理中含量最高的是未酰化花色苷，为45.27%，其次才是香豆酰化花色苷，为35.07%，并且三种酰化形式花色苷相对含量都要少于转色后摘叶处理和对照组。由此可以看出，转色前摘叶在一定程度上抑制了花色苷的甲基化和酰化，这与PASTORE C等[20-21]的研究结果是一致的，浆果成熟过程中长时间高温灼烧或者曝光能显著减少花色苷的甲基化和酰化程度。

如表2所示，三种处理方式共检测到花翠素类3种，花青素类2种，甲基花翠素类3种，甲基花青素类3种，二甲基花翠素类5种。转色前摘叶处理组比对照组多检测到2种单葡萄糖苷花色苷单体（花青素-3-O-葡糖苷、甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷）和2种双葡萄糖苷花色苷（花翠素-3-O-（6-O-对香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷）。转色后摘叶处理组和对照处理组检测的花色苷单体种类一致。

表2 三种处理马瑟兰葡萄皮中花色苷的相对含量Table 2 Relative percentage of anthocyanins in Marselan grape skins with three types of treatments

转色前摘叶中相对含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷花色苷，为39.36%，其次是二甲花翠素-3-O-（6-O-对香豆酰）葡糖苷，相对含量为29.68%，再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相对含量为16.53%，三者共占了总花色苷的85.57%；而转色后摘叶处理和对照组中二甲花翠素-3-O-（6-O-对香豆酰）葡糖苷含量最高，分别为40.85%和39.70%，其次是二甲花翠素-3-O-葡糖苷，相对含量分别为29.45%和30.82%；再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相对含量分别是18.07%和18.88%，三者共占了总花色苷的88.37%和89.40%。

2.2 五种基本花色苷含量对比

由表3看出，在相同的称样质量和处理方法下，对照中只检测出4种基本花色苷，没有检测出花青素-3-O-葡糖苷。转色前摘叶检测出5种，其含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷367.5mg/kg；含量最低的是花翠素-3-O-葡萄苷，只有19.17 mg/kg。转色后摘叶处理也是检测到4种基本花色苷，只是含量较对照略高。而转色前摘叶处理中检测出了5种基本花色苷，比对照增加了花青素-3-O-葡糖苷，但含量极少，仅为9.81 mg/kg。有研究表明，葡萄果实中花青素-3-O-葡糖苷含量低不仅是因为它是甲基化及酰化花色苷的前体物质[22-23]，而且它在B环上含有的O-酚类中相邻的羟基官能团对酶较为敏感，更易氧化[24]。本研究中只有转色前摘叶处理组中检测出该类花青素，进一步说明了曝光能显著减少花色苷酰化程度，与PASTORE C等[20-21]研究结果一致。

表3 三种处理下马瑟兰葡萄果皮中5种花色苷含量Table 3 Contents of five kinds of anthocyanins in the Marselan grape skins with three types of treatments mg/kg

从五种基本花色苷含量分析，转色前、后摘叶均能增加花色苷的含量，而转色前摘叶处理效果更为显著。转色前摘叶处理的五类基本花色苷总量达到1 438.68 mg/kg，是对照组的3.16倍。其中含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡糖苷（1177.85mg/kg），是对照组的3.21倍。而转色后摘叶处理的五类基本花色苷总量为509.98mg/kg，含量略高于对照组（454.45 mg/kg）。这与MATSUYAMA S等[25-26]的研究结果一致，适当的摘叶处理可以增加花色苷含量及改变单体的组分。通过果际微气候调控改善果实的光照条件，一方面增加了花色苷的合成底物，另一方面促进了花色苷合成相关酶的活性以及基因的表达[27-29]。而本研究试验结果的获得是通过促进哪些基因的表达需要进一步探究。

3 结论

在烟台产区，摘叶措施能够有效增加马瑟兰酿酒葡萄中花色苷的单体种类和含量，并且转色前处理优于转色后处理。转色前处理比对照多检测出4种单体，增加了双葡萄糖苷花色苷的数量，但降低了花色苷的酰化程度，其基本花色苷总量是对照的3.16倍；转色后处理与对照组的花色苷单体种类相同，其花色苷总量略高于对照组。不同摘叶处理对于马瑟兰葡萄酒的影响还在进一步研究当中。