肺微浸润性腺癌EGFR基因突变特征及临床意义

李 明，柯 立，李传应，詹玛琍，程 民

近年来肺癌的发病率及死亡率不断攀升，已成为肿瘤相关死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要类型，靶向治疗使NSCLC的治疗效果有了卓越提升。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是与NSCLC靶向治疗密切相关的驱动基因，其在优势人群中的突变率为10%～50%[2]。携带EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者可从EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)靶向治疗中获益。

快速准确地评价EGFR基因突变状态对于制定NSCLC个体化治疗方案具有重要意义。肿瘤临床病理学特征可预测EGFR基因状态，因此可作为初步评估指标。近年来随着早期筛查流程的完善，中国人群中早期肺癌已成为就诊肺癌中的重要类型。目前早期肺腺癌，如原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)及微浸润性腺癌(microinvasion adenocarcinoma,MIA)中EGFR基因突变特征及临床意义的研究较少。该研究将分析肺MIA中EGFR基因突变状态与临床病理参数的相关性，并进行亚组分析，比较19Del及L858R突变型患者的临床病理特征差异，以期揭示两种突变型肺MIA临床病理背景的差异，从而为肺MIA分子分型的必要性提供依据，并为MIA临床处理及预后评估提供指导。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2015年1月～2017年6月期间于安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院)CT检查发现肺部结节，后手术切除治疗的病例共79例，均满足以下入组条件：依据2015版WHO肺肿瘤分类诊断标准，病理诊断证实为肺MIA[3]；可获取肿瘤组织用于EGFR基因突变检测；所有病例手术前未接受过放、化疗及其他治疗。所有手术切除肿瘤组织经10%中性缓冲福尔马林固定及常规石蜡包埋。收集临床病理学资料。所有病例的病理诊断、肿瘤微浸润性成分组织学亚型以及微浸润病灶最大径均由3位病理医师根据IASLC/ATS/ERS及WHO 诊断分类标准进行独立评价，意见不一致的病例经讨论以达成共识。入组病例年龄39～82岁，中位年龄58岁。所有病例计算吸烟指数(吸烟指数=每日吸烟量×吸烟年数)，吸烟指数≥400定义为吸烟病例；从未吸烟定义为不吸烟病例。

1.2EGFR基因突变检测采用QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒(德国Qiagen公司)从肿瘤组织中提取基因组DNA；对于肿瘤细胞比例<50%的组织，利用宏切割方法富集肿瘤细胞后再提取核酸。紫外分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Fisher公司)检测核酸浓度及评价纯度。采用Amoy Diagnostics EGFR基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物医药有限公司)，通过扩增阻滞突变系统-多聚酶链式反应(amplification refractory mutation system-real time polymerase chain reaction,ARMS-PCR)方法检测肿瘤组织EGFR基因状态，检测涵盖EGFR基因4个外显子的29种突变类型。依据试剂盒说明，设置PCR反应条件：第一阶段，95 ℃预变性5 min，1个循环；第二阶段，95 ℃变性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15个循环；第三阶段，93 ℃变性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31个循环；在第三阶段60 ℃时收集FAM及HEX信号。每次检测均设置阳性及阴性对照，每例样本均设置外部及内部质控对照以保证核酸模板质量和排除PCR抑制剂存在的可能。

1.3统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析。全组及亚组计数资料均应用χ2或Fisher精确检验方法进行相关性分析。所有检验均为双边检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肺MIAEGFR基因突变状态79例肺MIA中，EGFR野生型者19例(24.05%)，EGFR基因突变者60例(突变率75.95%)；其中外显子19缺失突变(19Del)28例(突变率35.44%)，外显子21 L858R点突变(L858R)30例(突变率37.97%)；此外，EGFR稀有突变2例(突变率2.53%)，其中1例携带单点稀有突变(外显子18 G719X点突变)，1例携带稀有双突变(外显子18 G719X点突变合并外显子20 S768I点突变)。

2.2肺MIAEGFR基因突变与临床病理学参数的相关性肺MIA EGFR基因状态与肿瘤微浸润性成分组织学亚型、肿瘤内纤维化及免疫细胞浸润情况显著相关(P<0.01)；与患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤部位、大小、数目、微浸润病灶最大径、外周血淋巴细胞百分比及影像学是否表现为磨玻璃样结节无显著相关性，见表1。EGFR基因突变常好发于微浸润性成分组织学亚型为附壁型及腺泡型者(P<0.01)，同时也好发于肿瘤内出现显著纤维化及免疫细胞浸润者(P<0.01)。

2.3肺MIAEGFR基因突变亚型与临床病理学参数的相关性亚组分析分别比较了两种常见的EGFR突变亚型(19Del及L858R)与临床病理参数的相关性。结果显示，肺MIA EGFR基因19Del或L858R突变均与肿瘤大小、微浸润灶最大径、肿瘤内存在纤维化及免疫细胞浸润显著相关(P<0.01，P<0.05)；与患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤部位、数目及微浸润成分组织学亚型等无显著相关性，见表2。

2.419Del及L858R突变型肺MIA临床病理特征的比较进一步比较了19Del及L858R突变型肺MIA之间临床病理特征的差异。19Del突变多好发于肿瘤病灶≤1 cm(P<0.01)、肿瘤微浸润灶最大径≤0.2 cm(P<0.01)、肿瘤内缺乏显著纤维化及免疫细胞浸润的肺MIA病例(P<0.01)；与L858R突变组相比，差异有统计学意义，见图1。L858R突变则多好发于肿瘤病灶>1 cm(P<0.01)、肿瘤微浸润灶最大径>0.2 cm(P<0.01)、肿瘤内存在显著纤维化及免疫细胞浸润的肺MIA病例(P<0.01)；与19Del突变组相比，差异有统计学意义(图1)。其他临床病理学背景特征，包括年龄、性别、吸烟状态、影像学表现、肿瘤部位、数目、微浸润性成分组织学亚型及外周血淋巴细胞百分比，结果显示两种EGFR突变亚型的肺MIA之间无显著差异。

3 讨论

近年来由于筛查流程逐渐完善，肺MIA已成为临床实践中肺癌的重要类型，但其EGFR基因突变特征及临床意义尚不明确，仅有少数基于日本人群的研究提示EGFR突变多见于MIA[4-5]。本研究分析了79例肺MIA的EGFR基因突变特征，结果显示肺MIA中EGFR基因突变率为75.95%。EGFR基因突变谱显示19Del及L858R为主要突变亚型，这与在浸润性腺癌中观察到结果一致[6]；此外本研究检测到2例稀有突变，其中1例携带稀有双突变。基于本研究结果，推测肺MIA中EGFR基因突变具有独特的分子病理学特点，如突变率更高及更易出现稀有突变等，需要更大样本量的研究进一步证实。

表1 肺MIA EGFR基因突变与临床病理参数的相关性

aGGO(ground glass opacity)：磨玻璃样结节影;b入组病例微浸润灶最大径的平均值为0.2，如果存在多灶性浸润，则按照多灶性浸润性病灶的百分比之和乘以肿瘤最大径计算数值;c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸润灶组织学亚型，包括乳头状、微乳头状及实性亚型;d入组病例外周血淋巴细胞百分比平均值为30%

表2 肺微浸润性腺癌EGFR基因突变亚型与临床病理参数的相关性

aGGO (ground glass opacity)：磨玻璃样结节影；b入组病例微浸润灶最大径的平均值为0.2；如果存在多灶性浸润，则按照多灶性浸润性病灶的百分比之和乘以肿瘤最大径计算数值；c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸润灶组织学亚型，包括乳头状,微乳头状及实性亚型；d入组病例外周血淋巴细胞百分比平均值为30%。

EGFR基因突变可作为EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC的疗效预测因子，最近多项研究开始探讨TKIs在早期肺癌治疗中的疗效及安全性[7-10]。明确肺MIA中EGFR基因突变特征及临床意义有助于探讨肺癌发生的早期分子机制及制定合理的早期肺癌临床处理策略。本研究首先分析了EGFR突变状态与MIA临床病理学特征的相关性，结果显示EGFR突变多发生于微浸润性成分为附壁状或腺泡状组织亚型的MIA(表1)，这与在浸润性腺癌中观察到的结果相似[5]。此外，本研究显示EGFR突变多见于肿瘤内存在显著纤维化及免疫细胞浸润的MIA病例(表1)，目前尚无肺癌中EGFR突变与此两种病理特征的相关性研究。基于本研究结果，推测肿瘤内纤维化及免疫细胞浸润可提示肺MIA乃至浸润性腺癌存在EGFR突变。另一方面，有研究[11-12]提示肿瘤微环境改变，包括肿瘤内纤维化及免疫细胞浸润，可影响肿瘤细胞增殖及浸润；并提出此两种组织学特征可作为某些肿瘤的预后标志物。综合以上结果，推测肺MIA中EGFR突变状态与肿瘤预后有相关性，有待于进一步的研究论证。

图1 19Del及L858R突变型肺MIA临床病理特征的比较亚组1：肿瘤大小≤1 cm(n=46)； 亚组2： 1 cm<肿瘤大小≤2 cm(n=33)；亚组3：肿瘤微浸润灶最大径≤0.2 cm(n=34)； 亚组4：0.2 cm<肿瘤微浸润灶最大径≤0.5 cm(n=45)；亚组5：肿瘤内存在纤维化(n=46)；亚组6：肿瘤内缺乏纤维化(n=33)； 亚组7：肿瘤内存在免疫细胞浸润(n=38)；亚组8：肿瘤内缺乏免疫细胞浸润(n=41)；与L858R突变率比较：**P<0.01

本研究进一步分析了EGFR 19Del及L858R突变亚型与临床病理学特征之间的相关性。亚组分析显示EGFR 19Del及L858R突变均与肿瘤大小及微浸润灶最大径有显著相关性，亚组分析与全组分析结果之间的差异性表明不同EGFR突变亚型的肺MIA具有显著不同的临床病理学特征。另一方面本研究比较了19Del及L858R突变型MIA之间的临床病理特征，结果显示两者存在差异，尤其是两者具有不同的肿瘤微环境病理特征，体现在肿瘤内纤维化及免疫细胞浸润。鉴于此两种组织学特征可能作为肿瘤的预后标志物[11-12]，因此推测肺MIA临床结局与EGFR突变亚型密切相关，但需要进一步研究证实这一假说。有研究[2,13]提示19Del及L858R突变型肺浸润性腺癌之间存在着临床特征、生物学行为及对TKIs疗效的差异，但尚无研究探讨两种EGFR突变型MIA之间的差异。本研究结果提示不同EGFR突变亚型的MIA在病理组织学特征、预后等方面可能不同，临床处理中需要区别对待。MIA真实预后情况尚未完全明确[14]，少数报道显示早期肺癌中EGFR突变状态与预后无相关性[15]。本研究结果初步提示EGFR突变亚型可作为肺MIA临床研究中预后分层的分子标志物，但有待于进一步的研究证实。

本研究提示肺MIA可能具有特殊的EGFR基因突变谱。全组分析显示不同EGFR基因状态的肺MIA具有不同的临床病理特征，EGFR突变状态与肿瘤预后有相关性；亚组分析显示19Del及L858R突变型肺MIA之间存在显著差别，应被视为不同肿瘤。本研究初步探讨了肺MIA EGFR基因突变特征及临床意义，并为证实在肺MIA预后评估及临床处理过程中进行分子分型的必要性提供了初步依据。