D896N突变型EGFR稳转细胞株的构建及其对吉非替尼敏感性的研究

潘 婧，彭 佳，潘跃银

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种多结构域的跨膜酪氨酸激酶受体，由胞外配位区、跨膜区以及在胞内带有调控羧基末端的酪氨酸激酶区组成。EGFR激活后可以激活其下游多种信号通路，在细胞的增殖、分化以及血管形成等方面发挥重要作用[1]。EGFR突变与多种肿瘤的发生发展相关，研究[2]表明，约40%的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者携带EGFR的阳性突变。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)在EGFR突变阳性患者中的治疗效果显著[3]。第一代EGFR-TKI(代表药物为吉非替尼、厄罗替尼)通过结合EGFR酪氨酸激酶，阻断EGFR的活化及下游信号传导从而发挥作用[4]。虽然有相当一部分EGFR阳性突变的NSCLC患者靶向治疗疗效良好，但是，并不是所有EGFR激酶区的突变都有驱动作用或是对药物敏感[5]。在临床工作中，一位NSCLC患者的淋巴组织中检测到了EGFR罕见突变D896N。根据NCBI上EGFR基因的序列，D896N是EGFR的酪氨酸激酶功能区(EGFR的18～24外显子为酪氨酸激酶功能区)第896位密码子的点突变，导致天冬氨酸变为天冬酰胺。该患者在检测出突变位点后，采取厄罗替尼治疗，经检查淋巴结有缩小。该位点至今尚无相关报道，意义不明，因此需要通过构建新的细胞株实验来判断该位点EGFR突变对于药物的敏感性。

1 材料与方法

1.1材料Tel-EGFR N端质粒、C端质粒、MLV、VSVG四种质粒和293T细胞、Ba/F3细胞、宿主菌DH5α均由中国科学院合肥物质研究院强磁场中心刘青松实验室保存，其中N端质粒为包含有Tel基因及野生型EGFR N端部分序列的MSCV质粒，C端质粒则为野生型EGFR的C端部分序列。293T细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，BA/F3细胞培养于含有10%胎牛血清、10 ng/ml IL-3、100 U/ml 链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI 1640培养基中。

1.2主要试剂限制性内切酶EcoR I、BamH I，PCR用DNA聚合酶Prime Star和蛋白质预染Marker，核酸提取纯化试剂盒(美国Thermo公司)；转染试剂TransIn EL,Polybrene(美国Sigma公司)；Opti-MEM(Minimal Esential Medium)(美国Gibco公司)；兔抗EGFR抗体、兔抗p-EGFR抗体、鼠抗β-actin、兔二抗、鼠二抗(美国CST公司)；

1.3MSCV-Tel-EGFRD896N重组质粒构建及鉴定

1.3.1PCR获得D896N点突变的Tel-EGFR序列 根据NCBI上EGFR基因的序列，进行引物设计。上游引物：5′-TATACCCACCAGAGTAACGTCTGGAGCTACGGG-3′，下游引物：5′-CCCGTAGCTCCAGACGTTACTCTGGTGGGTATA-3′。模板为已有的Tel-EGFR C端质粒，普通PCR进行点突变。PCR反应体系总共20 μl，包括Tel-EGFR C端质粒模板0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，PrimeStar 10 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应体系：95 ℃预变性3 min、95 ℃变性30 s、61℃退火20 s、72 ℃延伸70 s，此过程共25个循环；之后72 ℃ 5 min。产物经1%琼脂糖电泳，验证后普通PCR将突变前后序列连接，以前述所得突变位点前后序列为模板。PCR反应体系总共20 μl，包括稀释模板0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，Prime Star 10 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应体系：95 ℃预变性3 min、95 ℃变性30 s、61 ℃退火20 s、72 ℃延伸2 min，此过程共5个循环；之后95 ℃变性30 s、72 ℃退火20 s、72 ℃延伸2 min；最后72 ℃ 5 min。产物经1%琼脂糖电泳，验证后纯化。

1.3.2质粒的重组与鉴定 用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切带有Tel-EGFR N端序列的载体，于37 ℃酶切2 h后纯化。将产物及前述步骤纯化所得产物经1%琼脂糖电泳，验证后以1 ∶1的比例进行PCR连接重组。重组体系共10 μl，包括前述所得产物各3.5 μl，重组酶1 μl，5×CE Buffer 2 μl，于PCR仪中37 ℃ 30 min。重组质粒构建后，宿主菌DH5α感受态细胞进行转化，均匀涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基表面，37 ℃培养18～24 h后挑取阳性克隆，置于37 ℃温箱摇床，摇菌过夜后，质粒抽提，37 ℃下酶切验证，之后测序鉴定。

1.4构建稳定转染的细胞株

1.4.1慢病毒的包装 转染前将293T细胞调整密度为2×105/ml加入6孔板中培养，次日观察细胞密度达到80%时进行转染。慢病毒包装过程如下：1.5 ml离心管中加入250 μl Opti-MEM培养基，依次加入重组质粒2 μg， VSVG 0.5 μg，MLV 0.5 μg，轻柔震荡混匀后加入TransIn EL 9 μl，再次轻柔震荡混匀后室温静置20 min，形成复合物。静置期间6孔板换液。20 min后将复合物均匀加入到6孔板中，轻微摇晃6孔板使复合物分布均匀。将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h后，收集上清液，经0.45 μm针式滤器过滤后获得病毒液，4 ℃冷藏待用。

1.4.2病毒转染Ba/F3细胞 细胞计数后取约1×106个细胞，离心后弃去上清液，用包装好的病毒液将细胞重悬，加入浓度0.1%的Polybrene，2 300 r/min离心90 min，离心结束后移入6孔板。对照孔中铺1×106个Ba/F3细胞，普通培养液培养。将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h后，换液，两孔均换为含有0.1% Puromycin的普通培养液培养，进行抗生素筛选，48 h后观察细胞。

1.4.3Western blot法检测EGFR及p-EGFR蛋白的表达 将转染了D896N突变型EGFR质粒的Ba/F3细胞裂解，离心后取蛋白上清液，制样。浓缩胶120 V电泳30 min后，分离胶80 V电泳1 h，100 V恒压转膜，5%浓度的脱脂牛奶封闭1 h，以EGFR、p-EGFR抗体为一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜3遍，加兔二抗，室温孵育1 h，再次TBST洗膜3遍后曝光显影。

1.4.4观察撤除培养基中IL-3后对细胞的影响 将Ba/F3-Tel-EGFR D896N细胞培养液中的IL-3浓度每隔48 h按1 ∶2的梯度降低，直至撤除IL-3。以不加IL-3培养的Ba/F3-Tel-EGFR L858R细胞为对照，观察细胞生长情况。

1.4.5Western blot法检测药物对磷酸化影响 Ba/F3-Tel-EGFR D896N和Ba/F3-Tel-EGFR L858R细胞计数后,各取1×106个/孔6孔板铺板，均加入吉非替尼，浓度梯度设置为0、50、100、250、500、1 000 nmol/L。加药后将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养0.5 h后，收集细胞裂解，离心后收集蛋白上清液，制样。浓缩胶120 V电泳30 min后，分离胶80 V电泳1 h，100 V恒压转膜，5%浓度的脱脂牛奶封闭1 h，以EGFR、p-EGFR抗体为一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜3遍，加兔二抗，室温孵育1 h，再次TBST洗膜3遍后曝光显影。ImageJ处理条带后，通过GraphPad计算获得各组半数抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)值。

2 结果

2.1重组慢病毒载体构建与鉴定酶切验证后对重组质粒进行测序，并与NCBI基因库中的EGFR基因序列比对，突变位点正确无误，质粒构建成功(图1)。

2.2Ba/F3-Tel-EGFRD896N细胞株构建与验证提取总蛋白，Western blot 结果显示稳定转染的细胞中有明显的EGFR及p-EGFR蛋白的表达，对照组Ba/F3细胞中则无EGFR及p-EGFR蛋白的表达，Ba/F3-Tel-EGFR D896N细胞株转染构建成功(图2)。

图1 重组质粒点突变测序报告

图2 Western blot检测稳转细胞内EGFR和P-EGFR的表达A：对照组BA/F3细胞中EGFR、P-EGFR蛋白的表达；B：BA/F3-Tel-EGFR D896N细胞中EGFR、P-EGFR蛋白的表达

2.3撤除IL-3培养Ba/F3-Tel-EGFRL858R及Ba/F3-Tel-EGFRD896N细胞撤除IL-3后Ba/F3-Tel-EGFR D896N细胞无法正常生长，而对照组Ba/F3-Tel-EGFR L858R在不含IL-3的培养液中依然正常生长(图3)。

2.4吉非替尼处理后Ba/F3-Tel-EGFRL858R和Ba/F3-Tel-EGFRD896N细胞中p-EGFR的表达按梯度将浓度为0、50、100、250、500、1 000 nmol/L的吉非替尼依次加入培养基对细胞进行处理后，两种细胞中EGFR磷酸化程度均随吉非替尼浓度增高逐渐降低(图4)。用ImageJ处理后，通过GraphPad计算获得各组IC50值，吉非替尼对Ba/F3-Tel-EGFR L858R和Ba/F3-Tel-EGFR D896N的IC50值分别为60.29 nmol/L和48.03 nmol/L，差异无统计学意义(P=0.076)。见图5。

图3 光学显微镜观察细胞撤除IL-3后的生长情况 ×100A：BA/F3-Tel-EGFR D896N细胞IL-3培养及撤除IL-3培养后4 d细胞生长变化；B：BA/F3-Tel-EGFR L858R细胞IL-3培养及撤除IL-3培养后4 d细胞生长变化

图4 Western blot检测吉非替尼处理后Ba/F3-Tel-EGFRL858R和BA/F3-Tel-EGFR D896N细胞中P-EGFR的表达A：BA/F3-Tel-EGFR L858R细胞中EGFR磷酸化程度随吉非替尼浓度增高发生的变化；B：BA/F3-Tel-EGFR D896N细胞中EGFR磷酸化程度随吉非替尼浓度增高发生的变化；1：0 nmol/L；2：50 nmol/L；3：100 nmol/L；4：250 nmol/L；5：500 nmol/L；6：1 000 nmol/L

3 讨论

与传统的脂质体相比，慢病毒载体需要和辅助质粒共转染进行病毒包装后来感染宿主细胞，以达到实验目的。尽管操作上相对复杂，但是慢病毒转染可将目的基因整合至细胞的染色体DNA中，从而使细胞株长期稳定地表达目的蛋白[6]。本实验选用的Ba/F3细胞,是一种小鼠B淋巴细胞[7]。选用该细胞，一是由于受体酪氨酸激酶途径在该细胞系中几乎不存在，因此为实验转染突变型EGFR，构建稳定转染的细胞株提供了一个纯净的背景；二是由于其正常的生长和增殖需要依赖一定浓度的IL-3，便于比较其生长和增殖条件的变化[8]。

图5 Ba/F3-Tel-EGFR L858R细胞和Ba/F3-Tel-EGFRD896N细胞对于吉非替尼敏感性曲线图

EGFR为胞膜上的受体，与配体结合后二聚化，从而磷酸化激活下游通路，在细胞的增殖、迁移以及血管生成等方面发挥重要作用。在不存在酪氨酸激酶系统的Ba/F3细胞中，即使通过转染使其携带野生型的EGFR，因为没有EGF等配体的刺激，细胞中的EGFR即使成功表达也无法被激活，细胞仍然需要依赖IL-3才能正常生长。在肺癌患者中常见的EGFR突变主要有19外显子的缺失突变和21外显子上的L858R突变[9]。突变可使EGFR在不依赖配体的情况下发生自我磷酸化激活下游通路。将此类突变型的EGFR转入Ba/F3细胞，即使细胞内不存在使其发生二聚的配体，因其突变可使EGFR发生自我磷酸化，从而激活下游的信号通路[10]。因此携带突变型EGFR的BA/F3细胞在撤除IL-3后，仍能依赖EGFR及其下游通路正常生长增殖。

TEL全长约300 kb，是一段与白血病发生相关的基因[11]。将其插入带有EGFR序列的载体克隆得Tel-EGFR，转染Ba/F3细胞并表达，EGFR可在不依赖配体的情况下转化为二聚体从而激活下游通路。Wang et al[12]已经用这种方法成功完成了一些突变型EGFR相关的实验。Tel基因可使EGFR在不需要配体的情况下发生磷酸化，激活下游通路，从而使Ba/F3细胞在不依赖IL-3的情况下仍然正常生长。因此通过这种方法构建携带不同突变型EGFR的细胞株，比较不同细胞株中的EGFR磷酸化程度。本实验即以此方法成功构建质粒，转染Ba/F3细胞。从结果来看，Western blot检测到Ba/F3-Tel-EGFR D896N细胞中表达的EGFR及p-EGFR蛋白，证明细胞内EGFR已成功表达并有明显的磷酸化发生，但是细胞在撤除IL-3后无法维持正常的生长。研究[13]表明，EGFR含有28个外显子，其中，18～24外显子编码酪氨酸激酶功能区。根据NCBI上的EGFR序列查询，D896N位于EGFR的22外显子，属于酪氨酸激酶功能区。因此，可以合理地猜测，该突变并非驱动突变，相反地，甚至在一定程度上破坏了EGFR的功能，虽然EGFR仍然能够发生磷酸化，已然不足以维持细胞的正常生长。

氨基端小叶(N-lobe，由18～20外显子编码)，αC螺旋及羧基端小叶(C-lobe，由21～24外显子编码)是EGFR的酪氨酸激酶激活区内的3个重要结构。存在于羧基端小叶内的活化环(A-loop)，被证实是酪氨酸激酶的活化中心。DFG序列位于A-loop的起始端，具有高度保守性。DCF序列发生改变会对激酶的活性产生一定影响。常见的L858R突变位于DFG序列后一位，研究[14]证实该突变增加了A-loop的稳定性，从而使EGFR对EGFR-TKI的敏感性增加。Western blot结果表明，Ba/F3-Tel-EGFR D896N在吉非替尼的刺激下EGFR磷酸化程度明显降低。而D896N位于EGFR的22外显子，即与L858R同样位于羧基端小叶。由此可以推测，D896N突变改变了激酶的活性，使EGFR对吉非替尼的敏感性增加。

由于构建的Ba/F3-Tel-EGFR D896N细胞无法在撤除IL-3的培养液中正常生长，故无法进行增殖及凋亡实验来与Ba/F3-Tel-EGFR L858R细胞对照研究，仅能依靠EGFR的磷酸化情况进行初步推测，还需结合临床及动物实验进一步探究考证。