PKH26荧光素标记脂肪间充质干细胞的生物学特性的研究

黄绍代，王 玉，鲁长风，陈 鹏，王 冲，刘雪剑，孙百川，张凯红，荆晓光，胡 丹，彭 江，田建伟,2

干细胞移植技术的广泛研究，为临床上治疗各种疾病提供了新的思路。而种子细胞的选择是干细胞移植的基本要素，脂肪干细胞具有来源丰富、取材方便、对供体损伤小、增殖分化能力强等优势，是目前干细胞移植的理想选择。很多预临床实验都证实脂肪干细胞对缺血性心脏病有一定的治疗效果[1-2]，但对于干细胞植入体内后的转归以及干细胞发挥作用的机制仍然不是很明确[3]。因此，提供一个简单高效的干细胞标志方法，研究干细胞移植后在体内的存活率、迁移转归和分布已成为干细胞移植研究领域的热点之一。而一个好的细胞标志物需具备不易洗脱、不易被代谢、标记后的信号容易被检测等特点[4]。PKH26是目前应用较多的一种亲脂性细胞标志物，已有文献[5-6]报道了PKH26用于示踪间充质干细胞以及神经干细胞的研究。该研究探讨PKH26荧光素染料对脂肪干细胞的生物学特性的影响，为进一步研究干细胞的迁移转归及示踪提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级新生SD大鼠8只，雌雄不限，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2实验试剂和设备PKH26荧光染料/二型胶原酶(美国Sigma公司)；低糖DMEM/胎牛血清(美国CORNING公司)；PBS(中国索莱宝公司)；双抗(美国Gibco公司)； CD45/CD11b(美国BD公司)；CD34/CD29/CD44/CD105(英国Abcam公司)；成脂诱导液/成骨诱导液/成软骨诱导液 (中国Cyagen公司)；CCK8试剂盒(日本DOJINDO公司)；流式细胞仪(型号:FACSCelesta,美国BD公司)；微量孔板分光光度计(型号：EPOCH TAKE3，美国Biotek公司)；DP70荧光显微镜、IX70倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；YT-CJ-2NB超净工作台(北京亚泰公司)；低速台式离心机(北京白洋公司)。

1.3实验方法

1.3.1脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的分离培养 取新生SD大鼠8只，雌雄不限，浸泡于体积分数75%的乙醇溶液中5 min，移入超净工作台，乙醚麻醉，小心剥离腹股沟区的皮下脂肪组织，用眼科剪小心剥除筋膜组织，转移至PBS溶液中清洗2～3次，将洗净的脂肪组织转移至青霉素小瓶中，用眼科剪剪成 1～3 mm3，加入8 ml 0.1%的二型胶原酶，置于磁力搅拌器37 ℃消化30～40 min。加入培养液终止消化，1 700 r/min离心 5 min，弃上清液，用配制好的低糖DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，放置于37 ℃体积分数5% CO2的恒温培养箱中进行培养。48 h后换液去除未贴壁的细胞，细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶消化传代，按1 ∶3比例进行扩增传代。

1.3.2PKH26标记ADSCs 胰酶消化P2代的ADSCs形成2×107个/cm2的细胞悬液，加入无血清培养基，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，使剩余液体低于25 μl，加入1 ml 试剂盒中稀释液C，制备完全离散的细胞悬液。配制染色液：将4 μl的PKH26乙醇染料加入离心管中，再加入1 ml 稀释液C制备染料溶液。尽快将离散的1 ml细胞悬液加入到配好的染液中，并用吸管均匀快速的混合，常温孵育2～5 min，可轻轻颠倒混匀。加入2 ml的血清孵育1 min终止染色，再用4 ml含血清培养基稀释终止的反应液，800 r/min离心10 min，吸弃上清液。再加入10 ml完全培养基，重复离心2次，每次800 r/min离心5 min，最后用10 ml完全培养基重悬到所需浓度，用合适的细胞浓度接种于培养瓶中，第2天在荧光显微镜下观察细胞被标记的情况。

1.3.3ADSCs的免疫表型分析 胰酶消化P2代的ADSCs制成细胞悬液，加入无血清培养基，800 r/min离心5 min，再用无血清培养基按照5.0×105个/ml密度进行重悬，吸取1 ml细胞悬液分别加入到7个15 ml聚丙烯离心管中，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，留下约200 μl的液体，加入CD34-APC、CD45-PE、CD29-PE、CD44-APC、CD105-APC、CD11b-FITC室温避光孵育20 min，加入PBS清洗未结合抗体，用流式细胞仪检测各抗体的表达情况。

1.3.4ADSCs成脂诱导及鉴定 胰酶消化P2代PKH26标记和未标记的ADSCs,以2×104个/cm2的密度接种于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培养液培养24 h后，吸弃完全培养液，每孔加入2 ml配好的成脂诱导A液(A液基础培养基、胎牛血清、双抗、谷氨酰胺、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、地塞米松)，诱导3 d后，吸掉六孔板中的A液，加入2 ml配好的成脂诱导B液(B液基础培养基、胎牛血清、双抗、谷氨酰胺、胰岛素)，24 h后，吸弃B液，换回A液继续诱导，A液和B液交替诱导3～4次(8～10 d)。诱导结束后，吸走六孔板中的成脂诱导培养基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸弃甲醛溶液，每孔加入1 ml配好的油红O染液染色30 min，显微镜下观察染色结果。

1.3.5脂肪干细胞成骨诱导及鉴定 胰酶消化P2代PKH26标记和未标记的ADSCs,以2×104个/cm2的密度接种于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培养液培养24 h后，吸弃完全培养液，每孔加入2 ml配好的成骨诱导液(基础培养基、血清、双抗、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松),之后每隔3 d换一次成骨诱导液，直至诱导3周。诱导结束后，吸走成骨诱导培养基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸弃甲醛溶液，每孔加入1 ml茜素红染液染色3～5 min，显微镜下观察染色结果。

1.3.6脂肪干细胞成软骨诱导及鉴定 胰酶消化P2代PKH26标记和未标记的ADSCs，用配制的预混液(基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸)以5.0×105个/ml的密度进行重悬，吸取1 ml细胞悬液转移至15 ml的离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清液，加入0.5 ml的成软骨诱导液(预混液，TGF-β3)，拧松离心管盖，将其置于培养箱中培养，72 h后小心更换诱导液，直至诱导28 d。诱导结束后，软骨球经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后切片，染色前先脱蜡和脱水，用阿利新蓝染液，染色30 min，自来水冲洗2 min后水性封片剂封片，显微镜下观察染色效果。

1.3.7CCK8检测ADSCs的增殖能力 胰酶消化P2代PKH26标记和未标记的ADSCs，以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μl培养液，接种后连续培养6 d，每天在相同时间选择6个孔(3个标记的ADSCs，3个未标记的ADSCs)加入10 μl的CCK8液，再在培养箱中孵育3 h，最后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(optical density,OD)。以3个孔OD值的平均值为纵坐标，对应的培养时间为横坐标，绘制出ADSCs的生长曲线。

2 结果

2.1ADSCs光镜下的形态学观察倒置相差显微镜下观察原代培养的ADSCs，细胞在未贴壁时大多呈圆形，折光性强，24 h后基本贴壁，细胞贴壁呈长梭形、多角形(图1A)，48 h后，可传P1代培养，传代后细胞仍呈长梭形，轮廓清晰，呈旋涡状或放射状排列生长(图1B)。当细胞融合度达到80%～90%时，传P2代培养，传代后细胞排列紧密，呈鱼群样生长(图1C)。细胞用PKH26标记后形态无明显变化，荧光显微镜下可见红色荧光染料呈颗粒状均匀的分布于ADSCs的细胞膜上(图1D)。

2.2ADSCs免疫表型鉴定结果培养至P2代，流式细胞仪分析的结果显示：95.3%的细胞CD44阳性，95.0%的细胞CD105阳性，94.6%的细胞CD29阳性，而仅有0.2%的细胞CD34阳性，5.4%的细胞CD45阳性，0.2%的细胞CD11b阳性，证实培养的是ADSCs，见图2。

图1 原代培养ADSCs的生长情况和PKH26标记ADSCs后的形态 ×100A：P0代ADSCs；B：P1代ADSCs；C：P2代ADSCs；D：PKH26标记的ADSCs

2.3PKH26标记前后ADSCs分化能力情况成脂诱导后的3 d可见细胞逐渐回缩成多角形，并可见少量的脂滴，诱导8 d后的油红O染色可见细胞内脂滴呈红色(蓝色箭头,图3A和图3D)。成骨诱导后3 d，细胞逐渐变为长梭形，约10 d左右可见少量的钙结节沉积，诱导21 d后可见大量的钙结节，茜素红染色可见橘红色的钙结节(黄色箭头，图3B和图3E)。成软骨诱导72 h后可见细胞逐渐聚集肉眼可见的小团，诱导14 d后细胞团逐渐透明成软骨形态，阿利新蓝染色后可见软骨组织中的内酸性粘多糖(红色箭头，图3C和图3F)。通过对比图3A和图3D，图3B和图3E，图3C和图3F发现，PKH26对ADSCs的成脂、成骨、成软骨的分化能力无影响。

2.4ADSCs已标记与未标记的增殖能力比较CCK8结果分析显示，细胞在第2～4天生长速度最快，处于对数生长期，之后进入平台期，细胞生长曲线见图4。分光光度计测定标记前后的细胞在各时间点的吸光度值见表1，统计分析结果显示，细胞在标记前后各时间点的吸光度值的差异均无统计学意义(P>0.05)。

图2 P2代ADSCs流式细胞仪检测结果

表1 PKH26标记前后的细胞在各时间点的OD值

图3 PKH26标记前后ADSCs成脂、成骨、成软骨诱导分化结果A、D：PKH26标记前后的ADSCs成脂诱导后油红O染色(蓝色箭头：红色脂滴)×100；B、E：PKH26标记前后的ADSCs成骨诱导后茜素红染色(黄色箭头：橘红色的钙结节)×100；C、F：PKH26标记前后的ADSCs成软骨诱导后的阿利新蓝染色(红色箭头：软骨组织中的内酸性粘多糖)×400

图4 PKH26标记和未标记的ADSCs生长曲线对照组：未用PKH26标记的ADSCs的生长曲线;PKH26组:PKH26标记后的ADSCs的生长曲线

3 讨论

目前研究比较多的细胞标志物有BrdU、放射性同位素、绿色荧光蛋白以及PKH26[7-8]。其中PKH26作为一种亲脂性荧光染料，能够不可逆地均匀的结合在细胞膜脂质双分子层上，荧光显微镜下可见红色荧光(激发光波长551 nm)。另外，荧光保留时间长，标记细胞种类广泛，被标记的细胞在细胞分裂后，荧光染料也可均匀的分布于两个子细胞中，而且标记后对细胞的生物学功能和增殖活性无影响，已成为研究细胞的迁移转归及示踪的理想标志物。本研究从新生SD大鼠腹股沟区的皮下脂肪分离培养得到ADSCs，经流式细胞仪和成脂、成骨、成软骨鉴定了ADSCs的免疫表型和多向分化的能力，结果均符合ADSCs的生物学特征[9-10]。用PKH26成功标记ADSCs后，光镜下的结果显示PKH26荧光素染料标记的ADSCs与未标记的ADSCs在形态上无明显差异。在标记24 h后荧光显微镜下也可观察到ADSCs细胞膜上均匀分布的强红色荧光。将PKH26标记的ADSCs进行成脂、成骨、成软骨诱导后发现PKH26并不影响ADSCs的多向分化能力，CCK8检测结果显示PKH26标记后对ADSCs的增殖活性无明显影响。

近几年大量文献报道了关于PKH26标记细胞后示踪其在体内迁移转归的研究。例如，Garikipati et al[11]通过将PKH26标记的间充质干细胞植入大鼠心肌梗死模型中，用于示踪间充质干细胞移植后在梗死区域的停留率。同样的， Tang et al[12]也通过将PKH26标记的心脏干细胞移植于老鼠心肌梗死模型中，用于研究血管内皮生长因子对移植的心脏干细胞的影响。另外，Huang et al[13]将PKH26标记的ADSCs注入大脑中动脉梗塞的老鼠体内，研究ADSCs在移植后的体内分布情况。国内学者薛改 等[14]通过PKH26标记人脐带间充质干细胞，观察人脐带间充质干细胞移植在肝硬化大鼠体内后的迁移情况，通过对PKH26标记的人脐带间充质干细胞进行传代培养发现每次传代后细胞荧光会逐渐衰减，但体外标记一次荧光可维持至20 d左右。这为干细胞的体内示踪研究提供了依据，研究者可通过活体荧光机追踪或者荧光显微镜下观察荧光信号的分布，再结合相应的组织免疫荧光进行进一步分析。