缬草提取物对睡眠障碍阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆与抗氧化能力的影响

张忠立 左月明

(江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004)

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性的中枢神经系统退行性疾病，睡眠障碍(SD)能影响AD的认知功能，加重AD患者的记忆力损伤〔1〕。缬草提取物是从败酱科植物缬草ValerianaofficinalisLinn.根及根茎中提取得到，主要含有环烯醚萜类、倍半萜类和木脂素类等化学成分，具有抗焦虑、抗抑郁、改善睡眠、神经保护和治疗AD等作用〔2,3〕。本文建立睡眠障碍阿尔茨海默病(SDAD)模型，研究缬草提取物对SDAD模型大鼠学习记忆、改善睡眠及抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD大鼠，雄性，体重(360±20)g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2014-0005。

1.2药物及试剂 缬草提取物各组由本课题组提供；多奈哌齐购于卫材药业有限公司；D-半乳糖和β-淀粉样蛋白(Aβ)1～40购于Sigma公司；过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器 YLS-1B多功能大鼠自主活动记录仪与MP-100生理实验信号采集分析系统(济南益延科技发展有限公司)，ZS-B型脑立体定位仪、Morris水迷宫分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)，UV8100紫外-可见分光光度计(美国莱伯泰科有限公司)。

1.4分组与造模方法 将156只SD雄性大鼠按体重随机分13组，分别为空白组，SDAD模型组，缬草醇提物脱脂高剂量(1.143 g/kg)、中剂量(0.571 g/kg)组，水洗脱物高剂量(0.756 g/kg)、中剂量(0.378 g/kg)组，20%乙醇洗脱物高剂量(0.097 g/kg)、中剂量(0.049 g/kg)组，40%乙醇洗脱物高剂量(0.092 g/kg)、中剂量(0.046 g/kg)组，70%乙醇洗脱物高剂量(0.028 g/kg)、中剂量(0.014 g/kg)组，多奈哌齐(0.001 g/kg)组。除空白组外其余各组腹腔注射D-半乳糖4 w，每天1次，造成亚急性衰老，并从第8天开始利用改良多平台水环境法(将大鼠置于注水的水箱内，水面低于平台约1.0 cm，大鼠在平台上可以自行摄食饮水和活动。当大鼠进入睡眠时，由于全身肌肉张力降低，导致躯体失衡而触水惊醒，确保大鼠不能进入睡眠期。空白组与睡眠剥夺组大小一样的水箱，但大鼠放在网上，网下置水至网格下1 cm，生活环境与睡眠剥夺组相似)进行睡眠剥夺3 w(第2周每天剥夺6 h、第3周每天剥夺9 h、第4周每天剥夺12 h)，4 w后取未死亡状态良好的大鼠再脑内注射凝聚态Aβ1～40〔4〕。手术后第3天，空白组和模型组灌胃生理盐水6 d，给药组连续灌胃给药6 d，1次/d。末次给药后，测定大鼠自主活动次数、学习记忆功能及血清中的各生化指标变化。

1.5Morris水迷宫实验 水池内放置清洁自来水并加入墨汁，水面高于平台2 cm，平台放于第Ⅳ象限，在其他3个象限任选一点将大鼠放入水中训练4 d，于第5天将平台移走，每只大鼠游1 min，记录每只大鼠第1次经过原平台的时间(潜伏期)，每只大鼠在1 min内经过平台的次数、计算大鼠在第Ⅳ象限游泳距离(I4)占整个游泳距离(I总)的百分比(第Ⅳ象限逗留距离)和在第Ⅳ象限游泳时间(t4)占整个游泳时间(t总)的百分比(第Ⅳ象限逗留时间)〔4〕。

1.6大鼠睡眠障碍的行为学测试 连接小动物自主活动检测装置与MP-100生理实验信号采集分析系统，随机在每个装置内放1只实验大鼠，每次检测前让动物在装置内适应5 min，检测室内保持安静，防止对大鼠的活动产生影响。记录各组大鼠于末次给药1 h后3 min内的自主活动次数，并称量大鼠体重变化。

1.7各生化指标的测定 水迷宫实验和自主活动测试结束后，行心脏采血，离心后取血清，按试剂盒说明书测定血清CAT、SOD、MDA、T-AOC、AChE、GSH-Px等水平。

1.8统计学方法 采用SAS9.3软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1缬草提取物对大鼠学习记忆的影响 水迷宫实验，与空白组比较，模型组大鼠潜伏期长、过台次数少，在第Ⅳ象限逗留时间和距离短(P<0.01)；与模型组比较，多奈哌齐组、缬草提取物各组能缩短潜伏期、增加过台次数，在第Ⅳ象限逗留时间和距离延长(P<0.05或P<0.01)，尤其是缬草醇提物脱脂组、20%乙醇洗脱物组和70%乙醇洗脱物组效果明显(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 缬草提取物对SDAD模型大鼠水迷宫探索实验结果

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.2缬草提取物对大鼠睡眠障碍的行为学影响 与空白组比较，模型组大鼠自主活动次数减少(睡眠障碍、精神萎靡不振，大鼠毛色凌乱、行动迟缓等表现)，体重增加缓慢(P<0.01)；与模型组比较，多奈哌齐组、缬草提取物各组能使模型动物的自主活动次数增加，动物的精神状态明显好转，体重增加速度趋于正常(P<0.05或P<0.01)。见表2。

2.3缬草提取物对大鼠血清相关指标的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中CAT、T-AOC、SOD、GSH-Px含量降低(P<0.01)，AChE活力增强(P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.01)；给药各组AChE、MDA含量降低，CAT、T-AOC、SOD、GSH-Px含量增加，与模型组相比具有显著差异(P<0.05或P<0.01)，尤其是多奈哌齐组、缬草醇提物脱脂组、20%乙醇洗脱物组和70%乙醇洗脱物组效果明显，能使SDAD模型大鼠脑内CAT、T-AOC、GSH-Px的活力恢复，降低AChE、MDA含量，增强清除自由基的能力。见表3。

表2 缬草提取物对SDAD模型大鼠改善睡眠障碍行为学试验的影响

表3 缬草提取物对SDAD模型大鼠血清生化指标的影响

3 讨 论

AD临床表现主要为记忆力减退、定向障碍、判断推理能力受损和睡眠障碍等，其中睡眠障碍SD既是AD的病因又是病症的临床表现之一，它能加速AD的进一步发展，并能影响AD的认知功能，加重AD患者的记忆力损伤。研究表明〔5〕，约44%AD患者伴发睡眠障碍，随着年龄的增长，老年人昼夜节律和睡眠-觉醒调节系统逐渐退化，导致脑组织中Aβ沉积增多，促使AD的发生。本实验通过对成年大鼠注射半乳糖同时发生睡眠剥夺后再脑室注射β淀粉样蛋白制作SDAD动物模型，Morris水迷宫行为学测试和自主活动测试结果显示造模成功。MDA、SOD和GSH-Px是衡量机体抗氧化能力的重要指标〔6〕，MDA是脂质过氧化的产物，可反映氧化应激对机体损害程度，SOD和GSH-Px活性可反映机体清除超氧阴离子自由基能力〔7〕。T-AOC是反映机体自由基损伤程度的生化指标，自由基过多且不被清除是导致机体衰老的重要原因之一〔8〕。CAT是重要的自由基清除剂，对体内氧平衡起到重要作用〔9〕。Ach是脑内重要神经递质，其含量高低与学习记忆正相关，AD患者AChE活性升高，Ach含量不足，学习记忆能力下降〔10〕。本研究发现，SDAD模型组大鼠学习记忆能力下降，精神萎靡不振，体重增加缓慢，血清中自由基的生成增多，脂质过氧化反应明显；而缬草提取物给药组能改善模型大鼠学习记忆能力，使动物的精神状态明显好转，体重增加速度趋于正常，血清中CAT、T-AOC的活力恢复，SOD、GSH-Px的水平提高，AChE、MDA的含量降低，表现出良好的抗氧化损伤作用。可见，缬草提取物(尤其是缬草醇提物脱脂组、20%乙醇洗脱物组和70%乙醇洗脱物组)可有效清除氧自由基，提高机体的抗氧化能力来改善模型动物睡眠障碍引起的学习记忆功能，对AD的发生发展起到一定的防治作用。