芽孢杆菌产溶藻活性物质的环境稳定性研究

司晓光，张晓青，郝建安，杜瑾，张爱君，曹军瑞

国家海洋局 天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192

作为一种全球性海洋灾害，赤潮已经引起世界各国的高度关注。科研人员进行了诸多研究和探索，以应对频繁发生的赤潮灾害，以期能有效地防治赤潮，减少其引发的危害和损失[1-3]。

微生物具有种类多、繁殖迅速、功能丰富等特点，因此在治理赤潮中具有极大的优势。近年来，科研人员对赤潮的微生物防治方法进行了大量研究，取得了一些很好的成果，其中利用微生物自身分泌的具有溶藻作用的胞外物质进行溶藻是目前研究的热点[4-6]。迄今，已报道的溶藻活性物质主要包括蛋白质类、氨基酸类、多肽类、表面活性剂、抗生素等[7-10]。

微生物产生的溶藻活性物质对环境条件的要求较高，对其实际应用有一定的影响[11-14]。为此，我们研究了本实验室获得的芽孢杆菌产溶藻活性物质的环境稳定性，探讨其对温度、酸碱度、反复冻融的耐受性以及贮存时的活性衰减周期，获得了最佳使用、运输和贮存条件，为该活性物质在赤潮治理中的实际应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

芽孢杆菌（Bacillus）dhs-330-021为本实验室保存菌种，由dhs-330转座突变库筛选获得；链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）购自上海光语生物科技有限公司，为典型赤潮藻。

dhs-330-021发酵培养基：葡萄糖32 g（单独灭菌），尿素5.0 g，酵母提取物1.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.0 g，KH2PO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，微量元素溶液（CaCl27.5 g/L，FeSO4·7H2O 2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.0 g/L）1.0 mL，定容至1 L并调整pH至7.0，115℃灭菌30 min。

链状亚历山大藻培养基（f/2培养基）：NaNO3（75.0 g/L）1 mL，NaH2PO4·H2O（5.0 g/L）1 mL，NaSiO3·9H2O（30.0 g/L）1 mL，微量元素溶液［FeCl3·6H2O 3.15 g，Na2EDTA·2H2O 4.36 g，CuSO4·5H2O（9.8 g/L）1 mL，NaMoO4·2H2O（6.3 g/L）1 mL，ZnSO4·7H2O（22.0 g/L）1 mL，CoCl2·6H2O（10.0 g/L）1 mL，MnCl2·4H2O（180.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］1 mL，维生素溶液［维生素B1200 mg，维生素H（1.0 g/L）1 mL，维生素B12（1.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］0.5 mL，用过滤海水定容至1 L。

1.2 溶藻物质分离

将dhs-330-021接种于发酵培养基，30℃、180 r/min振荡培养24 h，取50 mL，10 000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌，再用0.22 μm滤膜过滤至无菌蓝盖瓶中，获得溶藻活性物质。

1.3 溶藻物质的温度耐受性实验

将获得的溶藻活性物质水浴，分别加热到20、30、40、50和60℃，保温24 h，再冷却至室温，加到链状亚历山大藻的藻液中，添加量为2%，光照强度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔 24 h取样，用血球计数器计数。

1.4 溶藻物质的酸碱耐受性实验

将获得的溶藻活性物质用0.2 mol/L的HCl和0.2 mol/L的NaOH调节pH值分别至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，室温放置24 h，再用0.2 mol/L的NaOH和0.2 mol/L的HCl调节pH值为7.0，分别加到链状亚历山大藻的藻液中，添加量为2%，光照强度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取样，用血球计数器计数。

1.5 反复冻融对溶藻物质的影响

将溶藻活性物质置于-20℃冰箱中冷冻后取出，室温融化，反复冷冻融化5、10、15和20次，与未经冻融的溶藻物质对照进行实验，分别加到链状亚历山大藻的藻液中，添加量为2%，光照强度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取样，用血球计数器计数。

1.6 溶藻物质的活性衰减周期

将获得的溶藻活性物质于4℃冰箱中保存，分别取放置时间为0、1、3、6、9、12个月的溶藻活性物质添加到藻细胞液中，添加量为2%，光照强度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取样，用血球计数器计数。

2 结果

2.1 温度对溶藻物质的影响

图1结果显示，随着处理时间的增加，藻细胞密度逐渐降低，20℃处理组的藻液培养96 h后藻细胞密度为0.62×103/mL，与初始藻细胞密度1.83×104/mL相比，溶藻率为96.6%，而30、40、50和60℃处理组的溶藻率分别为97.2%、97.8%、89.2%和83.9%，可见在50℃以下溶藻活性物质的热稳定性较好。

图1 处理温度对溶藻物质活性的影响

2.2 pH值对溶藻物质的影响

从图2实验结果可以看出，处理96 h后不同pH值处理组的藻细胞密度不同，对照组和pH11处理组的藻细胞密度明显高于其他组。分析数据发现，对照组和pH11处理组的溶藻物质对藻细胞没有抑制作用，藻细胞均呈增加的趋势，而pH3、pH5、pH7和pH9处理组的溶藻率分别为95.2%、95.0%、95.2%和87.5%。由此可以得出，溶藻活性物质在强碱性条件（pH11）下失去溶藻活性，但能耐受弱碱和酸性条件，酸碱耐受范围为pH3～9。

2.3 反复冻融对溶藻物质的影响

图3显示了添加不同冻融次数的溶藻物质对藻细胞密度的影响。可以看出添加不同冻融次数的溶藻物质对藻细胞密度有一定的影响，冻融0、5、10、15和 20次组的溶藻率分别为 97.6%、97.2%、94.3%、89.8%和86.9%，呈现逐渐降低的趋势，这表明反复冻融对溶藻物质的活性有一定的影响，冻融15次内仍能保持90%以上的溶藻率，可以认为对反复冻融具有一定的耐受性。

图2 酸碱度对溶藻物质活性的影响

图3 反复冻融对溶藻物质活性的影响

2.4 溶藻物质的活性衰减周期

图4中的曲线表示贮存时间对溶藻物质溶藻活性的影响，结果表明随着时间的延长，溶藻物质的活性逐渐降低，贮存6个月内的溶藻率仍保持在90%以上，可以认为是一种比较稳定的溶藻物质。

3 讨论

溶藻物质的种类繁多，结构性质差异较大，对环境稳定性的要求也不同。魏雅冬等发现的一株溶藻细菌产的胞外物质具有很强的热稳定性，121℃处理后仍有很好的溶藻效果，但在强酸性（pH2.0）条件下丧失活性[15]。汪辉等发现了一株无色杆菌属的菌株能分泌一种耐高温和蛋白酶处理的活性物质，该物质能强烈抑制铜绿微囊藻的生长[16]。

我们对芽孢杆菌dhs-330-021产的溶藻物质的环境稳定性研究表明，该物质对温度的耐受性较好，随温度的升高溶藻率逐渐下降，50℃时仍能维持90%以上的溶藻率；同时，该物质对温度的变化不敏感，反复冻融15次内，溶藻率仍大于90%。酸碱耐受性实验结果表明，pH3～9时该物质的溶藻率为87.5%～95.2%，pH11时则丧失溶藻活性，具有耐酸不耐强碱的特性。另外，该物质在常温贮存条件下，溶藻活性逐渐降低，6个月内的溶藻率仍能保持90%以上。综上，该物质具有很好的环境稳定性，便于运输和储存，是一种具有很好应用前景的溶藻活性物质。

图4 贮存时间对溶藻物质活性的影响