溶藻细菌FS1的溶藻效果与机制初探

母锐敏， 贾静静， 张盛至

(1．山东建筑大学 市政与环境工程学院，山东 济南 250101;2. 山东亿能工程设计有限公司,山东 济南 250101)



溶藻细菌FS1的溶藻效果与机制初探

母锐敏1， 贾静静2， 张盛至1

(1．山东建筑大学 市政与环境工程学院，山东 济南 250101;2. 山东亿能工程设计有限公司,山东 济南 250101)

近年来，由水体富营养化引发的蓝藻水华频繁暴发，对水体生态系统平衡产生了重大影响，给人类健康也带来严重威胁。生物法除藻具有高效性、环境友好等优点，因此，如果能获得具有较高溶藻效率的溶藻细菌，选择生物法除藻更为理想。从菏泽一富营养化池塘分离得到1株溶藻细菌FS1，经16S rDNA测序分析鉴定为芽胞杆菌属。实验以铜绿微囊藻为研究对象，采用血球计数板法计算反应前后藻细胞的浓度，对不同生长阶段溶藻细菌FS1的溶藻效果进行了探究。停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的除藻率分别为7.1%、24.3%、57.0%和45.5%，结果表明，处于稳定期的FS1对铜绿微囊藻的去除效果最佳。细菌溶藻方式的研究结果表明，溶藻细菌是通过分泌溶藻物质间接溶解藻细胞。

溶藻细菌；除藻率；溶藻方式；铜绿微囊藻

近年来，由水体富营养化引起的有害藻类水华频繁暴发，严重影响着生态环境的平衡[1-3]，对人类的健康也产生了威胁。对于水体富营养化的治理，主要有物理方法、化学方法和生物方法[4-6]，但前两者投资大，且对水环境产生二次污染[7-8]，而生物除藻由于具有高效性、环境友好等特点，使其作为生物控藻手段显示出极大的潜力[9]。溶藻细菌被发现以来一直得到学术界的广泛关注。溶藻细菌的作用方式有直接溶藻和间接溶藻[10]，直接溶藻是溶藻细菌自身直接作用于藻细胞，使藻细胞溶解；间接溶藻是溶藻细菌通过分泌胞外溶藻物质溶藻或者细菌同藻竞争营养物质。本研究以水华常见藻类铜绿微囊藻为研究对象，溶藻细菌FS1分离自菏泽一富营养化池塘，针对溶藻细菌FS1对铜绿微囊藻的溶藻效果及其溶藻机理进行了初步探究，通过16S rDNA序列分析对FS1进行鉴定，并建立系统发育进化树。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试藻种 供试藻种为铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)，来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心(FACHB)，编号905，藻种活化后接种于BG11培养基中，置于人工气候室中静置培养，温度25 ℃，光照强度2 500 Lx，光暗周期比12 h∶12 h[11]。

1.1.2 培养基(g/L) 细菌培养基为LB培养基。液体LB培养基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨10；固体LB培养基：NaCl 10，酵母粉5，胰蛋白胨 10，琼脂15；铜绿微囊藻培养基为BG11培养基[12]：NaNO31.500，K2HPO40.040，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·2H2O 0.036，柠檬酸0.006，柠檬酸铁胺0.006，EDTA-2Na 0.001，NaCO30.020，A51 mL/L(A5溶液配方(g/L)：H3BO32.860，MnCl2·4H2O 1.810，ZnSO4·7H2O 0.222，NaMOO4·2H2O 0.030，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049)。

1.1.3 仪器 高速冷冻离心机(CR21GⅡ)，立式压力蒸汽灭菌器(澄医LS-B35L型)，超净工作台(博科13BS-SDC)，恒温摇床(上海天呈TS-100B)，显微镜(XSP-4C)，紫外分光光度计(VARIAN Cary50Probe)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 用无菌移液管吸取1 mL取自富营养化池塘的水样，加入9 mL无菌水中，制成10-1稀释液，依此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀释液[13-14]。各吸取0.2 mL稀释液置于相应编号的平板中，每个梯度3个平行样，将平板倒置于人工气候室中培养72 h后，采用划线法进一步纯化，得到纯菌株。

1.2.2 细菌溶藻效果 挑取纯化的菌落转接到50 mL灭菌的液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养至OD600值为2.0(菌体含量在109个/mL左右)。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀释藻液(将实验室培养至稳定期的铜绿微囊藻液稀释10倍，藻细胞个数在107个/mL左右)。4 d 内观察溶藻效果。采用血球计数板计数方法[15]对藻细胞进行计数，根据藻细胞数量的变化描述溶藻效果。

本研究中计数板为1 mm×1 mm方格25×16型，计数时，数左上、左下、右上、右下和中间5个(80小格)藻细胞数，计算公式：

藻细胞数(mL)=(80小格细胞总数/80)×400×10 000×稀释倍数

式中,C1为实验组藻细胞数，C2为对照组藻细胞数。

1.2.3 细菌溶藻方式 将细菌转接到50 mL液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养至OD600值为2.0(菌体含量在109个/mL左右)，制成原菌液。采取高温灭菌和高速离心处理原菌液[15-17]，得到高温灭菌(121 ℃，20 min)后的菌液、离心(12 000 r/min，20 min)沉降后的上清液和离心后的菌体。离心后的菌体加入150 mL无菌水，制成菌悬液。按1∶3的比例加入150 mL稀释藻液，对照组为50 mL液体培养基加150 mL稀释藻液。放入摇床(30 ℃，180 r/min)中反应，4 d内观察对比溶藻效果。

1.2.4 细菌生长曲线 用无菌移液管吸取1 mL 1.2.3中培养的原菌液于200 mL灭菌的培养基中，再于30 ℃、180 r/min摇床培养，进入稳定期前每隔1 h取样，进入稳定期后每隔2 h取样，用分光光度计在600 nm处测取菌液吸光度值，绘制生长曲线[18]。

1.2.5 细菌不同生长期对铜绿微囊藻生长的影响 根据1.2.4中的生长曲线，分别选取处于停滞期、对数期、稳定期和衰亡期菌液。向菌液中按1∶3的比例加入150 mL稀释藻液，设置对照组，对照组为50 mL灭菌的培养基加150 mL稀释藻液。加入藻液4 d内观察溶藻效果。

1.2.6 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列的相似性分析有助于溶藻细菌的分子生物学研究，也是溶藻细菌属性分类的关键指标[19]。本研究溶藻细菌FS1的16S rDNA序列分析由上海生工生物工程技术服务公司测定。对测定的溶藻细菌FS1的16S rDNA序列应用Blast程序和GenBank中的已知序列进行相似性对比，并进行系统发育分析，建立系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 溶藻细菌分离

从水样中分离得到6株细菌，编号为FS1～FS6，其中FS1的溶藻效果最为明显，其菌落为微凸型白色圆形菌落。

FS1菌液刚加入藻液时与加入藻液4 d后进行对比。加入藻液4 d后，对照组仍为绿色；实验组中的菌藻混合液由绿色变成黄色，最终完全黄化。显微镜下观察发现，视野中藻细胞的数量明显减少。通过对比可知，在溶藻细菌FS1的作用下，藻细胞大量死亡并且叶绿素被破坏，所以藻菌混合液颜色变黄，可初步判定细菌FS1为溶藻细菌。图1为对照组和实验组中藻细胞的数量变化对比，根据1.2.2中除藻率计算公式，计算出加入藻液后1、2、3和4 d的除藻率分别为32.6%、42.8%、51.2%和54.8%，具有显著的溶藻效果。

图1 对照组与实验组藻细胞数量变化Fig.1 The changment of control group and experimental group with Microcystis aeruginosa cells

2.2 溶藻细菌FS1的溶藻方式

反应4 d后，不同方式处理后菌液的溶藻效果如图2所示，原菌液和上清液的除藻率分别为54.8%和62.0%，高温热处理液和菌悬液的除藻率分别为6.4%和9.6%。高温热处理和菌悬液的溶藻效果不显著，然而菌悬液的除藻率高于高温热处理液，说明实验过程中菌悬液中的细菌恢复了溶藻能力，但是处于无菌水中的菌体没有在液体培养基中活性高，所以溶藻效果与原菌液差距较大。上清液仍有较好的溶藻效果，而菌悬液除藻率仅为9.6%，说明细菌FS1不是与藻细胞直接接触溶藻，而是通过分泌溶藻物质间接溶藻[20]。

图2 反应4 d后不同方式处理后的FS1菌液的溶藻效果Fig.2 The algicidal effect of bacterium FS1 with different treatment after four days

2.3 细菌生长曲线的测定

由图3可看出细菌FS1在0～1 h处于停滞期，1～8 h处于对数生长期，8～18 h处于稳定期，18 h后进入衰亡期。FS1是从液体培养基接种到液体培养基，生长环境基本没变，停滞期较短。参考《微生物学实验》[21]代时计算公式，计算出代时G=1.93 h，因为代时短细菌生长速率大，浓度增长快，所以溶藻细菌FS1能够在短时间内满足溶藻对细菌浓度的要求[16]。

图3 细菌FS1的生长曲线Fig.3 Growth curve of bacterium FS1

2.4 细菌不同生长期对铜绿微囊藻的溶解效果

不同生长期菌液的溶藻效果如图4所示。停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的除藻率分别为7.1%、24.3%、57.0%和45.5%。不同生长期的细菌均有一定的溶藻效果，但停滞期和对数期的菌液的溶藻能力远不及稳定期和衰亡期，这可能与细菌在生长阶段合成的溶藻物质积累有关，对于间接溶藻的细菌FS1来说，溶藻物质越多除藻率越高，稳定期和衰亡积累的溶藻物质最多，溶藻效果最好。但衰亡期的除藻率低于稳定期，推断是衰亡期的次代谢产物对溶藻效果产生了一定的抑制作用。卢兰兰等[22]也讨论了溶藻细菌不同生长期的溶藻效果，稳定期与衰亡期的溶藻能力最强。

图4 反应4 d后不同生长期菌液的溶藻效果Fig.4 The algicidal effect of different growth periods after four days

2.5 溶藻细菌FS1的16S rDNA序列分析

将FS1的16S rDNA序列分析结果在GenBank数据库进行Blast相似性检索分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，建立系统发育进化树(图5)。由图5可知，FS1与芽胞杆菌同源性为99%，初步鉴定为芽胞杆菌属，GenBank中收录号为KC523393。

图5 溶藻细菌FS1系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree of bacterium FS1

3 讨 论

本文以探究蓝藻水华的微生物控制为目的，选择导致蓝藻水华暴发的常见藻类铜绿微囊藻为研究目标，详细研究了溶藻细菌FS1的溶藻特性，初步探究了FS1的溶藻机理，并从分子生物学水平上对溶藻细菌FS1进行了鉴定。

细菌溶藻技术研究的基础是溶藻细菌的分离，筛选出高效、专一的溶藻细菌，并开发出安全、高效的生物杀藻剂，已日渐成为控制与治理蓝藻水华的新思路。本研究以蓝藻水华水体为分离源，共分离出6株纯细菌，选择溶藻效果显著的FS1溶藻细菌作为实验菌株，对溶藻细菌FS1利用16S rDNA序列分析方法进行鉴定，通过序列同源性比较分析和建立系统发育树表明溶藻细菌FS1属于芽胞杆菌属。对FS1的溶藻机理进行初步探究，研究不同方式处理的菌液的溶藻效果，结果表明，上清液的溶藻效果最好。通过分析得知FS1是通过释放溶藻物质间接溶藻，释放的胞外溶藻物质为非耐高温物质，在高温下失去溶藻活性。溶藻细菌的溶藻效果与细菌生长周期密切相关。对FS1处于停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的菌液进行溶藻效果研究，结果表明，FS1对铜绿微囊藻的溶藻效果在稳定期最好，衰亡期次之。这可能与细菌在生长阶段合成的溶藻物质积累有关，随着细菌的生长溶藻物质积累越多，溶藻效果越好，而在衰亡期，产生的次代谢产物对溶藻效果产生了一定的抑制作用。

本研究中分离的溶藻细菌FS1来源于自然水体，与环境有很好的相容性，与其他来源的细菌相比安全性更高，溶藻能力更具有针对性。由于FS1是通过分泌溶藻物质间接溶解藻细胞，对不同生长期细菌的溶藻效果进行研究是为了确定细菌何时溶藻效果最强，进而为今后的实际应用提供参考。生物除藻法是利用生物间的营养竞争和食物链关系来控制蓝藻水华，从整个生态系统的管理角度深入，具有经济性、合理性和高效性的特点，将成为控藻的主要手段。

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Initial Investigation on Algicidal Effect and Mechanism of Algae-lytic Bacteria FS1

MU Rui-min1, JIA Jing-jing2, ZHANG Sheng-zhi1

(1.Schl.ofMuni. &Environm’lEngin.,ShandongArchitec.Uni., 2.ShandongYiNengEngineeringDdsignCo.,Ltd,Jinan250101)

In recent years, frequent breaking out of algal blooms caused by eutrophication of waters have affected balance of waters ecological system eventfully, also seriously threatened human health. The algae elimination with biological method has the advantages of efficiency and environmental friendly. Therefore, it is an ideal matter to select biological method to eliminate the algae if a fairly effective an algae-lytic bacterium could be obtained. In this study, an algae-lytic bacterium named FS1 was isolated from an eutrophication pond in Heze, and identified asBacillussp. by the 16S rDNA sequence analysis. The experiment tookMicrocystisaeruginosaas the subject of the study. The algae-lytic effect of the algae-lytic bacterium FS1 in its different stage of growth was investigated adopting hemacytometer to calculate the concentration of algae cell. The algicidal effect of FS1 in its stagnant, logarithmic, stationary, and declining periods were at 7.1%, 24.3%, 57.0%, and 45.5% respectively. The results showed that the bacterium FS1 in its stationary growth period had the best removal rates againstMicrocystisaeruginosa. The research result of algicidal mode suggested that the bacterium FS1 lysedM.aeruginosaby excreting algae-lytic substance to lyse the algae cell indirectly.

algae-lytic bacteria; algicidal rate; algae-lytic mode;Microcystis aeruginosa

国家自然科学基金(51078224)；山东省中青年科学家奖励基金(BS2011SW024)；山东建筑大学博士基金(XNBS0910)

母锐敏 女，副教授，硕士生导师。研究方向为水污染控制理论与技术研究。E-mail: ruiminmu@163.com

2014-04-01；

2015-01-15

Q939.99;X172

A

1005-7021(2015)06-0016-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.003