基于Image J软件的裸鼠肝脏原位肿瘤图像定量分析方法

姜棋予，陈艳，李瑞生，孙慧伟，李晓娟，柴燕涛，王志杰，杨锐创，张莹石，冯帆，侯俊

解放军第三〇二医院 临床研究管理中心，北京 100039

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等在我国有很高的感染率，随着时间的推移以及疾病的逐渐进展，这些患者有很大的风险最终罹患肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），这使得肝细胞癌不仅严重危害我国人民健康，也是现阶段公共卫生事业的重大挑战[1]。目前，进展期肝细胞癌的药物治疗面临巨大挑战，这集中体现在：①进展期肝细胞癌对各种传统化疗药物均极不敏感[2]；②现有治疗策略是各种口服分子靶向药物，但这些药物价格昂贵，疗效在患者个体间的差异也很大[3]。因此，进展期肝细胞癌分子靶向药物的研发历来是研究的热点与难点。利用裸鼠等动物模型建立肝细胞癌肿瘤模型，是进展期肝细胞癌分子靶向治疗相关分子肿瘤学研究、分子药理学研究的基础。

尽管已经取得了诸多进展，但现有动物研究模型仍存在诸多不足：①裸鼠皮下肿瘤尽管是一种在体（in vivo）研究模型，但恶性肿瘤细胞在裸鼠皮下的生长与其在肝脏原位的实际生长状态有较大差异；②进展期肝细胞癌具有很强的转移与侵袭能力，尚无可靠与直观的在体研究模型可对此进行研究，需要建立更加直观和行之有效的肿瘤动物模型；③分子靶向药物相关药理学、药效学研究对结果的量化分析有较高要求，但现有研究策略更适用于定性研究，对定量研究的技术与方法储备不足，难以对肿瘤组织、脏器等照片文件进行定量分析。为解决这些问题，我们利用高侵袭性的肝细胞癌细胞MHCC97-H，经由肝门静脉注射接种裸鼠肝脏后形成多发与弥散的肿瘤病灶（nodules），利用Image J软件对肝脏脏器照片进行定量分析，可精确测定肿瘤病灶的面积以反映肿瘤大小与脏器病变程度。在此基础上，我们利用该技术进行了索拉非尼的药敏实验，获得了索拉非尼抗肿瘤作用的定量结果（对MHCC97-H在裸鼠肝脏形成病灶的抑制率）。

1 材料与方法

1.1 材料

免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）购自北京市斯贝福生物科技有限公司，吸入麻醉剂异氟烷购自深圳沃瑞德公司，小动物实验相关手术器械由本实验室保存；高侵袭性人肝细胞癌细胞系MHCC97-H为本实验室保存，用含10%胎牛血清（Invitrogen公司产品）的DMEM培养液（Invitrogen公司产品）培养；病理实验Masson染色试剂盒为北京中杉金桥公司产品；图像分析软件为Adobe Photoshop（版本号CS6 13.0×64）和Image J软件（版本号1.51j8，由美国国立卫生研究院发布）；DMSO、吐温80及PEG400等均为Sigma公司产品。

1.2 免疫缺陷小鼠肝脏原位肿瘤模型的建立[4]

培养MHCC97-H细胞，待其状态良好后，收集细胞并计数，用注射用水（灭菌的生理盐水）重悬，备用；雌性5～6周龄BALB/c品系免疫缺陷小鼠在洁净空间（SPE饲养条件）用经60Co-γ照射除菌的饲养垫料和饲料进行饲养。用吸入麻醉剂异氟烷在麻醉机持续麻醉实验动物（首次麻醉时异氟烷浓度为3.5%，持续麻醉时异氟烷浓度为1.5%～2.0%）。将麻醉的小鼠固定于粘鼠板上，在其腹部剑突下方剪开一个约1.5 cm的开口，轻轻挤出肝右叶后暴露肝门静脉，用医用注射器（灭菌注射器）在肝门静脉中注射MHCC97-H细胞悬液，注射的总体积为 100～200 μL，细胞量为 5×105。接种完毕，将肝叶推回腹腔内进行缝合，注意缝合的层次并缝合3～4针即可。如有少量出血则进行按压止血。

1.3 肝脏肿瘤多发与弥散病灶照片的定量分析

收集动物，获得肝脏脏器，拍照获得垂直视角图片。同时收集组织标本，将其制备为石蜡切片，进行Masson染色实验，对肿瘤病灶进行确认。在此基础上，对拍照所得的肝脏脏器照片进行图像定量分析：①用Photoshop软件打开获得的肝脏肿瘤垂直视角拍摄图片，用软件工具栏中的“磁性套索工具”，沿图片中小鼠肝脏边缘进行选取，复制所选区域粘贴于黑色背景中，保存图片；②将①中获得的黑色背景照片用Image J软件打开，点击路径ImageColorSplit Channels，可获得图片的红（R）、绿（G）、蓝（B）等3个RGB象限分析结果；③由于肝脏脏器在图片中呈现的主色调接近红色，为保证肿瘤颜色与肿瘤本体颜色的色差，故选取绿色或蓝色为下一步操作的图像，本次操作以绿色为操作图像；④点击菜单ImageAdjustThreshold路径，将第二排滚动条拖动至显示数值为“255”，第一排滚动条拖动至红色基本覆盖肿瘤部位，可确定肿瘤部位占整个图片的比例；⑤进一步，将第一排滚动条向左拖动，至数值显示为“1”，可确定肝脏脏器占整个图片的比例。

1.4 分子靶向药物敏感性检测实验

对前述获得的动物模型进行分子靶向治疗，将裸鼠分为2组，即对照组（未治疗组）和索拉非尼治疗组（灌胃给予2 mg/kg的索拉非尼，隔日给药）。待治疗10次（饲养3周左右）后，收集动物获得肝脏脏器，拍照后对图像进行定量分析，依据对照组与索拉非尼治疗组肿瘤组织占肝脏总面积的比例，计算索拉非尼作用于MHCC97-H细胞在裸鼠肝脏形成肿瘤病灶的抑制率：抑制率=（未治疗组肿瘤病灶面积-治疗组肿瘤病灶面积）/未治疗组肿瘤病灶面积。

1.5 统计学分析

结果显示为x±SD，用SPSS17.0软件，采用单因素方差分析计算P值，以P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 MHCC97-H细胞能够在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶

结果如图1所示，经由肝门静脉注射MHCC-97H细胞，可在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶（图1A）。在此基础上对肝脏标本进行病理染色（Masson染色）（图1B），能够清晰和直观地显示肿瘤组织与周围正常组织，对图1A的结果进行了确证。

2.2 裸鼠肝脏多发与弥散肿瘤病灶的图像定量分析

首先，用Photoshop软件沿鼠肝脏边缘进行选取，复制所选区域并粘贴后获得了背景为黑色的图片（图2A），用Image J软件获得了图片的RGB象限分析结果（图2B、C、D）。在此基础上，分别获得了肿瘤组织（图3）与肝脏脏器整体（图4）占整个图片面积比例。其中肿瘤组织占图片总面积的37.34%（图3），而肝脏脏器占图片总面积的75.05%（图4），因此，HCC病灶占肝脏脏器总面积的49.75%（37.34%/75.05%）。这表明，建立了基于图像分析软件Image J的肝脏脏器照片定量分析方法。

2.3 分子靶向药物索拉非尼抗肿瘤作用的图像定量分析

如前述，我们建立了对裸鼠肝脏肿瘤病灶的定量分析方法。在此基础上将其运用于药物索拉非尼抗肿瘤作用的图像定量分析，结果如图5所示，经由门静脉注射接种MHCC97-H细胞能够在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶，图5A为肝脏脏器照片，索拉非尼治疗能够显著抑制MHCC97-H细胞在裸鼠肝脏中形成肿瘤病灶的能力，未治疗组（对照组）5个脏器中，肿瘤病灶所占比例（即相对面积）分别为57.6%、62.2%、53.1%、49.7%和44.9%，而索拉非尼治疗组MHCC97-H细胞在肝脏形成的肿瘤病灶显著缩小，其占肝脏脏器的比例依次为14.2%、16.2%、10.6%、7.9%和23.8%。图5B为上述定量分析结果的散点图，图5C为依据数据所得索拉非尼作用于MHCC97-H细胞在肝脏形成肿瘤病灶的抑制率散点图。这表明，利用建立的图像分析方法可辅助药物敏感性研究，定量分析所得照片等图像文件。

图1 肝门静脉注射MHCC97-H细胞后能够形成多发与弥散的肿瘤病灶

图2 肝脏照片的选定及像限分析结果

图3 HCC肿瘤病灶的识别与总面积的定量分析

图4 肝脏脏器总面积的识别与肝脏面积的定量分析

图5 索拉非尼对MHCC97-H细胞在裸鼠肝脏形成肿瘤病灶的抑制作用

3 讨论

目前，受临床诊疗技术的限制，大多数HCC患者初诊即为进展期，失去了外科手术等根治性治疗的机会。由于进展期肝细胞癌对射线等放射治疗策略极不敏感，加之其对传统化疗药物也不敏感，因此临床诊疗受到极大限制，患者预后较差[5]。现有治疗药物主要是索拉非尼[6]、瑞戈非尼[7]及阿帕替尼[8]等分子靶向药物。索拉非尼已广泛用于临床，其药物耐受与毒副作用已有明确报道，瑞戈非尼与阿帕替尼也于近期获准上市。因此，对这些分子靶向药物的研究具有重要意义。但现有研究模型存在诸多不足：①对于皮下肿瘤可测算其肿瘤体积进行量化分析，但对于其他肿瘤模型，如肝脏原位肿瘤模型，获得照片等图像信息较为容易，而对图形信息进行定量分析较为困难；②以高内涵（high content analysis）等为代表的图像采集与分析系统对于图形文件格式等的要求较为严格，整个工作站价格昂贵，普及性差[9-10]。为此，本研究建立了一种基于Image J软件的图像定量分析方法。将MHCC97-H细胞经由肝门静脉注射裸鼠肝脏，能够在肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶，用Image J软件可特异和完整地将肝脏轮廓与多发与弥散的肿瘤病灶加以识别和选定，进而确定脏器、病灶的面积，二者的比值（即病灶占脏器总面积的比例）即可量化和直观地反映MHCC97-H细胞在裸鼠肝脏形成病灶的强度。

进展期肝细胞癌具有强烈的侵袭性生长与血管侵犯等病理特征[11]，因此本研究选取了MHCC97-H细胞这一高侵袭性的肝细胞癌细胞系模拟与反映进展期肝细胞癌具有的强烈的侵袭性生长特征。我们通过肝门静脉注射接种的方式，实现了MHCC97-H细胞在肝脏的血道转移与侵袭性生长，MHCC97-H细胞在裸鼠肝脏形成了多发与弥散的肿瘤病灶。与现有肿瘤转移与侵袭模型相比，本研究采取的模型具有诸多优势：①现有肿瘤转移的动物模型主要是通过尾静脉接种肿瘤细胞，肿瘤细胞通过下腔静脉回心后，立即经由肺动脉抵达肺部[12]。尽管能够获得肺部的肿瘤病灶，但肺部作为气体交换的器官有丰富的毛细血管网，肿瘤细胞经由血液循环路径直接和非特异地留驻与毛细血管等微循环部位，不能特异性地反映出肿瘤细胞在转移、侵袭过程中的各项生理变化；②肿瘤细胞经由肝门静脉进入肝脏，能够直接实现肿瘤细胞在肝脏内部的留驻，模拟肝转移。肝脏血管丰富，内部分布有大血管，而接近肝包膜处毛细血管丰富。肝脏较薄，留驻于近肝包膜处的MHCC97-H细胞随着其侵润性生长最终会突破肝包膜，在肝脏表面形成多发与弥散的肿瘤病灶；③本研究建立的肿瘤模型，不仅能够更好地模拟肿瘤细胞在肝脏原位的转移与侵润性生长，也适用于肺癌肝转移、乳腺癌肝转移等领域的研究。综上所述，本研究建立的方法，不仅有助于模拟肝细胞癌在肝脏原位的生长，也对相关药学研究具有重要意义。