表皮生长因子受体在三阴性乳腺癌细胞膜表面的电镜单分子成像研究

张晓菲,王丽,李劲涛,夏阳,吉元,盛望,韩晓东

北京工业大学 a.生命科学与生物工程学院；b.固体微结构与性能研究所；北京 100124

乳腺癌是女性发生率最高的恶性肿瘤，在我国其病死率呈逐年上升趋势，仅次于肺癌，占女性恶性肿瘤第二位[1-2]。乳腺癌有多种亚型[3]，其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均为阴性的一种特殊类型的乳腺癌，占乳腺癌的15%～20%[4]，缺乏有效的靶向治疗手段，预后较差，死亡率较高。

表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）是HER/ErbB家族成员，定位于细胞膜上[5]，在许多恶性肿瘤中异常高表达。有研究报道，肿瘤细胞内EGFR通过形成二聚体激活酪氨酸蛋白激酶并诱导下游蛋白磷酸化，从而启动下游信号通路，促进并调控肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤转移[6]。EGFR在TNBC中的表达水平比其他亚型乳腺癌高，目前被认为是TNBC防治的重要肿瘤靶点[7]。

近年来细胞原位单分子成像研究领域是交叉学科的研究热点之一。2006年庄小威等[8]报道了基于单分子荧光检测的超高分辨率成像方法，即随机光学重建显微法（STORM），基于光化学机制在实验室合成了超亮的可光控的染料及具有最佳性能的荧光蛋白。在此基础上也发展了高分辨荧光成像，发展了单分子超高分辨率的方法。2015，Peckys等利用量子点对乳腺癌细胞表面的HER2进行单分子研究，为单分子成像提供了丰富的理论依据[9]。

相比较于光学显微镜，电镜用电子束作为激发光源，不受衍射极限的限制，具有纳米级的分辨率。在此，我们利用EGFR特异的核酸适配体介导链接纳米金颗粒，用环境扫描电子显微镜观察研究了三阴性乳腺癌细胞的二次电子像，利用电子显微镜的超分辨率在纳米尺度对EGFR在该细胞表面的分布及聚集状态进行了成像分析研究。本研究为深入探讨EGFR作用机制和开发评价相应靶向药物提供了新的可视化研究手段，也为肿瘤防治提供了新的技术思路。

1 材料与方法

1.1 材料

三阴性乳腺癌细胞MB-231细胞系购于美国模式培养物集存库（ATCC）；链霉亲和素修饰的纳米金颗粒由NANOCS公司合成；特异性结合EGFR的核酸适配体序列TGCCGTTTCTTCTCTTT CGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATG[10]由生工生物工程股份有限公司合成；ITO导电玻璃购于上海聚笛玻璃公司。

1.2 MB-231细胞培养

在生物安全柜中将ITO导电玻璃置于75%酒精中浸泡30 min，紫外灯下照射30 min，放入12孔板中。将2×105/mL的MB-231细胞悬液铺在有ITO导电玻璃的12孔板中，培养24 h后，加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞30 min，用超纯水清洗培养有MB-231细胞的ITO导电玻璃5次，晾干后将浓度为20 mol/L的生物素标记的EGFR适配体室温敷育在ITO导电玻璃上，于湿盒中敷育1 h，用超纯水清洗干净，晾干后将链霉亲和素标记的金颗粒用超纯水稀释至1/10，滴在细胞上，放入湿盒中敷育1 h，用超纯水清洗ITO导电玻璃10次后晾干。

1.3 扫描电镜表征

采用FEI公司Quanta 600环境扫描电镜（environmental scanning electron microscope，ESEM）。ESEM成像模式[11]主要有二次电子（secondary electron，SE）像、背散射电子（backscattered electron，BSE）像。二次电子信号主要来自样品表层5～10 nm深度[12]，能量较低（小于50 eV），二次电子像具有分辨率高、景深大、立体感强的特点，主要分析来自样品表面的信息。背散射电子是被固体样品中的原子核反弹回来的一部分入射电子，能量很高，有相当部分接近入射电子能量。背散射电子像主要反映原子序数衬度。真空度模式有高真空、低真空、环境真空等3种模式，相应样品室压力为10-2～10-5、13～133、133～2600 Pa。入射电子束辐照能量2～30 keV可调，入射电流10-8～10-9A，大倍数20～200 000′连续调节。

1.4 统计分析

利用imageJ软件，随机选择细胞不同位置的照片5张，分析统计蛋白表达数目，量化蛋白点，计算单体、二聚体、多聚体分布数目及比值，分析其分布特点。

2 结果

2.1 MB-231细胞在扫描电镜下成像

MB-231细胞以单层细胞状态贴壁生长在ITO导电玻璃上，呈贴壁的梭型或椭圆形，扫描电镜表征，可以清晰地看到MB-231细胞的形态。图1为三阴性乳腺癌细胞MB-231细胞在200 μm尺度下的二次电子像（BSE像），加速电压为10 kV，spot size为3，可以清晰地看到细胞之间的胞间连丝。细胞生长状态良好，可用于后续的高分辨成像研究。

2.2 MB-231细胞表面标定EGFR单分子成像观察

利用环境扫描电子显微镜对标记金颗粒的三阴性乳腺癌细胞进行观察。由于每个EGFR分子仅结合1个金颗粒，因此1个金颗粒代表1个EGFR单分子。图2为三阴性乳腺癌细胞表面EGFR的扫描电镜成像图片。可以清晰地观察到EGFR既可以单分子状态存在，亦可以二聚体或多聚体（EGFR分子个数≥3）的形式存在。当2个或多个EGFR分子间距离小于15 nm时，我们认为其形成了二聚体或多聚体[13]。成像结果显示无论是EGFR单体还是二聚体或多聚体，均随机地分布在三阴性乳腺癌细胞表面，没有发现某个区域以单分子为主或某个区域以二聚体或多聚体为主的现象。由于缺乏单分子的超分辨率研究手段，目前有关EGFR的报道更多集中在其可形成二聚体上面，但对其多聚体现象却鲜见报道。从我们利用电镜实现单分子纳米尺度下的超分辨成像的统计结果来看，常规培养条件下EGFR单体在三阴性乳腺癌细胞表面所占比例为36.98%，二聚体比例为12.22%，而多聚体比例高达50.80%。该结果提示EGFR在三阴性乳腺癌细胞表面主要以二聚体和多聚体的形式存在，而非单体形式，EGFR二聚体和多聚体比例总和达62%以上。如果EGFR仅简单聚集成为二聚体即可激活其下游的信号转导通路并促进细胞的增殖、迁移和抗凋亡的话，我们的结果显示在三阴性乳腺癌细胞表面大于62%的EGFR分子是处于激活状态并调控细胞的生长、迁移等基本功能。

3 讨论

EGFR是相对分子质量为170 000的跨膜受体酪氨酸激酶。目前研究认为表皮细胞生长因子（epithelial growth factor，EGF）或转化生长因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）与 EGFR结合后，可以促使EGFR发生二聚体化，并通过改变其构象诱导自身的酪氨酸残基发生磷酸化，磷酸化的EGFR形成并暴露Grb2结合位点并与Grb2分子结合，Grb2分子通过2个SH3结构域与SOS的鸟苷酸交换因子结合并进一步活化Ras，激活Ras、MAPK和ERK等分子，最后ERK可转移到细胞核内参与调控细胞生长迁移等功能。因此，单分子的EGFR处于一种没有酪氨酸激酶活性的状态，且不具有启动调控或下游信号转导途径的功能。EGFR形成二聚体后可通过自身磷酸化启动下游信号通路并调控细胞状态。本研究结果表明包括二聚体在内的EGFR多聚体占其总数的比例超过了62%，这可以理解为在三阴性乳腺癌细胞表面绝大多数EGFR是处于聚体的激活状态。本研究结果与EGFR信号通路在肿瘤细胞中异常活跃，抗EGFR的小分子药物或抗体药物具有较好的抗肿瘤活性的结果相符。

图1 三阴性乳腺癌细胞MB-231的扫描电镜成像

图2 EGFR标定金颗粒在扫描电镜下成像

EGFR多聚体现象在有关EGFR的研究中鲜见报道，本研究发现EGFR二聚体比例在TNBC表面仅为12%左右，而其多聚体比例可达50.80%，说明超过50%的EGFR在TNBC表面以多聚体的形式存在。EGFR多聚体与二聚体在调控细胞的作用和功能上是否有区别及有何区别目前还未知。综上，我们利用电镜在纳米尺度上定量分析了EGFR在TNBC表面的分布及聚集状态，为进一步在纳米尺度的单分子水平全面揭示EGFR信号通路的调控机制及功能，研发高效的调控EGFR通路的抗肿瘤药物提供了新的研究手段和策略。