ATP生物发光法检测喷气燃料中真菌的污染程度

李泽振，熊云，陈波

1.中国人民解放军陆军勤务学院 油料系，重庆 401331；

2.驻中国石油化工股份有限公司镇海炼化分公司军代室，浙江 宁波 315207

自20世纪30年代以来，已有许多关于喷气燃料微生物污染的研究报道[1]。微生物的存在可能导致飞机燃油过滤器堵塞[2]、发动机损坏[3]、油量表故障及储油设备腐蚀[4]等问题。因喷气燃料储存地点及使用条件[5]的不同，其中的微生物类型也存在差异。真菌作为喷气燃料中的主要污染微生物[6]，亦是喷气燃料悬浮物问题的重要原因[7]，一直以来都是喷气燃料微生物污染领域的研究重点。Ferrari等分析了350份喷气燃料样本，发现主要污染真菌是枝孢霉菌及曲霉菌[8]。杨浩等通过对我国不同地区的喷气燃料油样进行微生物富集及测序分析，认为喷气燃料中的主要污染真菌为枝孢霉菌、青霉菌及曲霉菌等[9]。

ATP普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能[10]。通过测定样品中的ATP含量，即可间接推算出样品中的微生物数量。ATP生物发光法是一项通过检测整个反应过程中的荧光强度来衡量ATP含量的技术。McElroy最先引入萤光素酶-ATP检测法，其反应机理为：在Mg2+存在下，萤火虫萤光素酶以ATP、O2为底物，将化学能转化为光能，发出光量子，其发光强度与ATP浓度成正比，因此可通过测定发光强度来定量ATP浓度[11]。

目前对喷气燃料微生物的研究主要集中在污染菌种的鉴定及治理措施方面[12]，喷气燃料微生物污染程度的检测主要通过传统平板计数法，而平板计数法存在耗时久、操作复杂等缺点，因此建立一种能快速检测燃料中真菌污染程度的方法是有意义的。ATP生物发光法通过测量反应体系的荧光强度来分析从微生物中提取得到的ATP数量，并间接反应微生物数量，整个检测过程可在数分钟内完成。目前，ATP生物发光法已广泛用于食品卫生和环境监控等方面[13]，而在喷气燃料中微生物污染程度方面的研究还很少。我们研究了喷气燃料主要污染真菌的最佳ATP提取方法及荧光素-萤光素酶反应体系的筛选，初步建立了喷气燃料真菌污染程度的检测方法，并与传统平板计数法相比较，在一定范围内可以代替平板计数法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株枝孢霉菌（Amorphotheca resinae）、帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）、局限青霉（Penicilliμm restrictum）均为实验室保藏菌种，由污染喷气燃料中分离鉴定得到。试验用油为3号军用喷气燃料，由中国石油化工股份有限公司镇海炼化分公司提供。

沙保培养基（葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，琼脂粉1.5 g溶于100 mL蒸馏水，121℃灭菌20 min）自制；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、BAB（苯扎溴铵）、BAC（苯扎氯铵）、SDS（十二烷基硫酸钠）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；标准ATP试剂购于上海普洛麦格生物产品有限公司；3种荧光素-萤光素酶试剂分别购于国内3家公司。

单功能光吸收酶标仪VersaMax（美国Molecular Devices Corporation）；HY-LiTE Jet A1 Fuel Test（德国Merck公司）；Tomy SX快速自动高压灭菌器（日本Tomy Digital Biology公司）；ESCO OptiMair垂直流超净工作台（新加坡艺思高科技有限公司）；SPX-150培养箱（北京厚慧实验仪器有限公司）。

1.2 荧光素-萤光素酶体系的筛选

用ATP缓冲液将标准ATP试剂（10-2mol/L）分别稀释至 10-8、3×10-9、10-9、3×10-10、10-10、3×10-11mol/L，取各浓度ATP溶液50 μL分别加入100 μL 3种不同的荧光素-萤光素酶体系中，测定发光值，重复3次取平均值。

1.3 模拟污染喷气燃料

取在沙保培养基中培养2 d后的3种试验真菌菌液各5 mL，分别加入500 mL提前用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后的喷气燃料中，振荡混匀后静置3 d，作为3种真菌的模拟污染喷气燃料。另取培养好的3种试验真菌菌液各2 mL，同时加入500 mL过滤后的喷气燃料中，振荡混匀后静置3 d，作为混合菌的模拟污染喷气燃料。

1.4 ATP裂解液的筛选

用自制提取液分别富集3种真菌的模拟污染喷气燃料中的微生物，得到待测样品。各取1 mL待测样品分别加入1 mL 0.1%的BAC、BAB、CTAB及SDS溶液中，振荡混匀后室温作用1 min，取50 μL反应液加入 100 μL 筛选出的荧光素-萤光素酶反应体系中，测量发光值，以无菌水作为空白对照。每组试验重复3次，取均值。

1.5 BAC最佳裂解浓度确定

配置浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%及0.25%的BAC裂解液，取3种真菌的模拟污染喷气燃料提取后的待测样品各1 mL，分别加入1 mL不同浓度的BAC溶液中，轻微振荡混匀后于室温作用 1 min，取 50 μL 反应液加入 100 μL 荧光素-萤光素酶体系中，测量发光值。

1.6 BAC最佳裂解时间确定

取3种真菌的模拟污染喷气燃料提取后的待测样品各1 mL，分别加入1 mL 0.15%的BAC溶液中，轻微振荡混匀后分别于室温作用0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 min，之后分别取 50 μL反应液加入100 μL荧光素-萤光素酶体系中，测量发光值。

1.7 ATP生物发光法与平板计数法的相关性

试验真菌分别接入沙保斜面培养基，26℃培养7 d后加入5 mL无菌水，轻轻刮下斜面上的孢子，振荡过滤后得到孢子悬浮液，以血球板计数后4℃保存。用无菌水将真菌孢子悬浮液稀释至不同梯度，分别用传统平板计数法及ATP生物发光法检测，分析2种方法的相关性。

1.8 ATP生物发光法检测污染喷气燃料

平行培养1.3中的3种真菌及混合菌的模拟污染喷气燃料，每种各5组，并以无菌水代替菌液加入喷气燃料中作为空白对照。首先用自制提取液提取微生物得到待测样品，分别取1 mL待测样品加入1 mL 0.15%的BAC中作用30 s后，立即取50 μL反应液加入100 μL荧光素-萤光素酶体系中，测量发光值。每组试验重复3次，取均值，并通过测定各平行组的荧光值考察方法的重复性。

2 结果与讨论

2.1 荧光素-萤光素酶体系的筛选结果

荧光素-萤光素酶体系的筛选结果如图1所示。3种荧光体系中的C型荧光素-萤光素酶体系比A型相关性高，比B型线性范围广。通过回归分析，得出C型一元线性方程为y=0.8080x+8.3884（R2=0.9654），即当 ATP 浓度为 10-8～3×10-11mol/L时，荧光强度与ATP浓度有良好的线性关系，最终确定C型荧光素-萤光素酶体系。在实际使用情况下，因喷气燃料中的微生物数量较少，而在富集微生物和ATP释放过程中会有损耗，且存在人工操作和仪器检测的误差，所以需要更为灵敏稳定且检测限更低的荧光素-萤光素酶发光体系。

2.2 ATP裂解液筛选结果

各ATP裂解液对试验真菌的作用如表1所示。BAB、BAC及CTAB这3种表面活性剂裂解液效果较好，均能显著提高荧光强度，其中BAC效果最好且毒性更低，使用方便，是ATP裂解液的良好选择。

2.3 BAC最佳作用浓度确定

BAC的作用浓度筛选结果如图2A所示，可以看出3种试验真菌的荧光强度随BAC浓度的提高均是先增大后减小，当BAC浓度为0.15%时荧光强度最大。这可能是因为适量浓度的BAC可以增加ATP的释放效率，但过量的BAC会抑制萤光素酶的活性，导致荧光强度降低。确定BAC的最佳作用浓度为0.15%。

图1 3种荧光素-萤光素酶体系的ATP浓度与发光强度关系

2.4 BAC最佳作用时间确定

BAC的时间筛选结果如图2B所示，随着裂解时间的增长，3种试验真菌的荧光强度快速降低，这一方面是由荧光体系与ATP的反应过程决定的，另一方面可能是因为萤光素酶的稳定性不高而造成的。为了得到最大的荧光强度，确定BAC的最佳作用时间为30 s。

2.5 ATP生物发光法与传统平板计数法的相关性

将3种试验真菌的孢子悬液稀释至不同浓度梯度，分别采用ATP生物发光法及平板计数法计量其数量，结果如图3所示。在试验范围内，3种真菌的试验结果均线性相关，相关系数均在0.96以上，说明用ATP生物发光法检测真菌数量与传统平板计数法有良好的相关性。在实际应用中，因为喷气燃料中的污染菌种复杂多样，直接将荧光结果对应菌落总数是困难的，而荧光结果可以反应微生物数量，间接表征污染程度。

2.6 ATP生物发光法检测污染喷气燃料

用ATP生物发光法对5组平行培养的模拟污染喷气燃料的检测结果如表2。在各组的3次重复试验中，变异系数CV均小于3%，而各平行组的变异系数如表2所示，可见本方法对同一样本的检测重复性要高于平行组。推测是因为真菌的生长特性，难以确保各平行组内的真菌数量一致，而混合菌的生长情况更为复杂，所以其变异系数最高。在实际应用本方法时，因为喷气燃料中微生物生长情况复杂，难以将荧光结果对应菌落数，所以可以直接利用荧光强度的大小来区分不同的污染程度。

表1 不同裂解液的ATP裂解效果

表2 ATP生物发光法测量结果

图2 BAC作用浓度（A）和作用时间（B）对荧光强度的影响

图3 3种试验真菌的数量与荧光强度的关系

2.7 结论

筛选了国内A、B、C共3种荧光素-萤光素酶发光体系，结果表明C产品在10-8～3×10-11mol/L范围内，荧光强度与ATP浓度有良好的线性关系，其检测限可达10-15mol ATP，可以用来检测喷气燃料中的真菌的污染程度。

对4种常用的真菌ATP裂解液进行了筛选，并进一步研究了最佳作用浓度及时间，结果表明0.15%的BAC作用30 s后可明显提高荧光强度。

用ATP生物发光法及传统平板培养法对试验真菌的数量进行检测，结果表明2种方法有较好的关联性，在一定范围内，可以用ATP生物发光法检测喷气燃料中的真菌污染程度。

利用ATP生物发光法检测喷气燃料中真菌污染程度具有耗时短、操作简单且不需要大型仪器的优点，可以确保现场快速检测。但在现阶段还面临重复性低、检测限高等问题。但其作为一种初步检测方法，可以快速判定喷气燃料中是否存在微生物污染情况及污染的严重程度，如果出现污染情况，可以对污染油料作后续检测及治理，避免事故发生。