巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的性能验证

杨洋，吴恩应，陈玉琴，刘爱和，吴灼斌，林桓旭，黄伟荣，李彬，郭采平

深圳市卫光生物制品股份有限公司 药物研发中心，广东 深圳 518107

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒科β属的DNA病毒，在人群中传播广泛，我国成人的感染率超过95%，且巨细胞病毒的感染与地区、年龄、经济状况相关[1]。一般成人感染后临床症状较轻或不明显，但孕妇感染后可引起胎儿流产、死胎、先天性畸形及智力低下，还可导致器官移植等免疫功能低下的患者死亡[2-4]。因此，巨细胞病毒感染的早期快速诊断对控制巨细胞病毒传播、促进优生优育、降低器官移植患者死亡率有重要意义。我们采用间接ELISA法研制了巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒，对其性能进行了验证，为该试剂盒制定企业注册标准和确定生产工艺提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人巨细胞病毒抗原、抗人IgG-HRP购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；新生牛血清购自武汉三利生物技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自MP Biomedicals公司；96孔微孔板购自深圳市金灿华公司；TMB、Tween-20购自Amresco公司；巨细胞病毒IgG抗体参考品购自中国食品药品检定研究院（标准物质编号360004，批号201101，以下简称“国家参考品”）；巨细胞病毒IgG抗体企业参考品为深圳市卫光生物制品股份有限公司自产（批号20140710，以下简称“企业参考品”）；参比试剂巨细胞病毒IgG抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）购自珠海经济特区海泰生物制药有限公司（批号20140606，以下简称“参比试剂”）；待考核试剂为巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法），由本公司研制（批号20140701、20140702、20140703，以下简称“待考核试剂”）；第三方试剂巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（增强化学发光免疫分析法）购自北京泰格科信生物科技有限公司（批号20140603，以下简称“第三方试剂”）；其余普通化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；实验样本来源于深圳市第二人民医院、深圳市卫光生物制品股份有限公司单采血浆站。MK3酶标仪购自Thermo公司；PW-960全自动酶标洗板机购自深圳汇松公司；MB-1酶标板脱水机购自北京天石医疗公司；DK-600电热恒温水浴箱购自上海精宏公司；KBF.720恒温恒湿箱购自德国宾得公司。

1.2 HCMV IgG的检测

将待检样品按1∶101稀释，即取待测样品10 μL至1000 μL样品稀释液中，充分混匀，每孔加100 μL；设立空白对照2孔（从加底物开始实验），阴性对照、阳性对照和临界对照各2孔；覆盖封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完毕的反应板，弃去封板膜；洗板机洗板4次，300 μL/孔，浸泡20 s，干板；每孔加入酶结合物100 μL（空白对照孔除外），覆盖封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完毕的反应板，弃去封板膜，洗板4次，干板；加入100 μL TMB显色液（包括空白对照孔），轻轻振荡混匀；覆盖封板膜，置37℃避光孵育15 min；每孔加入100 μL终止液终止反应；终止后30 min内用酶标仪读取吸光度值，取单波长450 nm或双波长450 nm/630 nm测量。

1.3 HCMV IgG检测试剂盒的性能验证

1.3.1 技术指标 依据中华人民共和国医药行业标准《YY/T 1183-2010酶联免疫吸附法检测试剂（盒）》和《YY/T 1236-2014巨细胞病毒IgG/IgM抗体检测试剂（盒）》，对试剂盒的外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、重复性、检测限、批间差进行检测[6-7]。

1.3.1.1 外观 试剂盒外包装应完整，无破损；各组分应齐全、完整，液体应密封无泄漏；酶标板条应平整、无飞边、表面光洁度好、底部无波纹及划伤；液体组分应澄清透明，无絮状物；标识应清晰，易识别。

1.3.1.2 阳性参考品符合率 对10份阳性参考品进行检测，其结果应不得出现假阴性。

1.3.1.3 阴性参考品符合率 对5份阴性参考品进行检测，其结果应不得出现假阳性。

1.3.1.4 重复性 用重复性参考品重复检测10次，CV应≤15.0%。

1.3.1.5 检测限 对3份最低检出限参考品进行检测，应均能检出。

1.3.1.6 批间差 用3个批号的试剂盒分别对国家参考品L1、R、N1（强阳、弱阳、阴性）、企业参考品l1、r、n1（强阳、弱阳、阴性）进行测定，各10个复孔，计算30次结果的吸光度值值均数、标准差（SD）及变异系数（CV值）。

1.3.2 对比实验研究 用本公司研制的巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）与珠海经济特区海泰生物制药有限公司的巨细胞病毒IgG抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）同时检测1050例样本，进行对比实验研究[8-12]。

1.4 统计学分析

采用SPSS软件进行统计学分析。求出χ2检验、一致性系数Kappa值（κ），考察评价试剂与参比试剂检测结果的一致性及是否具有统计学意义上的差异。

2 结果

2.1 技术指标的验证

20170701、20170702、20170703批试剂盒检测10份阳性参考品（国家参考品，P1～P10），准确性（阳性符合率）均为100%；3批试剂盒分别检测5份阴性参考品（国家参考品，N1～N5），特异性（阴性符合率）均为100%；重复性CV值分别为1.7%（20140701批）、4.9%（20140702批）和 4.8%（20140703批）；批间变异系数分别为3.9%（强阳性）、7.2%（弱阳性）和5.3%（阴性），均小于等于15.0%；3份最低检出限国家参考品L1、L2、L3均能检出，且均为阳性。

20170701、20170702、20170703批试剂盒检测10份阳性参考品（企业参考品，p1～p10），准确性（阳性符合率）均为100%；3批试剂盒分别检测5份阴性参考品（企业参考品，n1～n5），特异性（阴性符合率）均为100%；重复性CV值分别为4.6%（20140701批）、3.6%（20140702批）和 1.9%（20140703批），批间变异系数分别为5.9%（强阳性）、5.9%（弱阳性）和6.1%（阴性），均小于等于15.0%；3份最低检出限参考品L1、L2、L3均能检出，且均为阳性。

以上技术指标均符合中华人民共和国医药行业标准《YY/T 1183-2010酶联免疫吸附法检测试剂（盒）》、《YY/T 1236-2014巨细胞病毒IgG/IgM抗体检测试剂（盒）》的要求。同时，将20140701、20140702、20140703批试剂盒送中国食品药品检定研究院检定，所检技术指标项目全部合格。

2.2 对比实验研究

用本公司研制的巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒与已上市的珠海海泰巨细胞病毒IgG抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）（国食药监械（准）字2013第3400423号）对1050份血清标本进行检测，可疑样本未进入计算。表4给出了诊断试验中常用的评价指标，本公司试剂盒的阳性符合率为98.92%（95%置信区间：98.18%～99.66%），阴性符合率为98.60%（95%置信区间：97.24%～99.96%），与已上市试剂盒的总符合率为98.83%（95%置信区间：98.17%～99.49%），假阳性率为1.40%，假阴性率为1.08%，阳性试验的预示值为99.46%，阴性实验的预示值为97.24%，Youden指数为0.9752，Kappa系数为 0.9710，一致性优，配对χ2检验的P＞0.05，待考核试剂和对比试剂的检测结果不一致部分不存在统计学意义上的差异。

1050例样本中，结果不一致的样本共有23例（其中13例第三方试剂与评价试剂测定结果一致，7例第三方试剂与对比试剂测定结果一致）。推断其原因可能是样本中巨细胞病毒IgG抗体含量位于待考核试剂最低检出限附近，同时样本和稀释液没有充分混匀，加样后读取试验结果的时间较早所致。

表1 国家参考品验证结果

表2 批间变异系数检测结果（n=30）

表3 企业参考品验证结果

表4 2种试剂盒检测1050例样本的结果

3 讨论

检测巨细胞病毒IgG抗体的免疫学方法有中和试验、补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫法、放射免疫法等[13]，但只有酶联免疫法具备操作简便、灵敏度高、特异性好、技术成熟的优点，且用于常规实验室[14-15]。

本公司研制的巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）按中华人民共和国医药行业标准《YY/T 1183-2010酶联免疫吸附法检测试剂（盒）》、《YY/T 1236-2014巨细胞病毒IgG/IgM抗体检测试剂（盒）》对国家参考品和企业参考品进行检测，各项指标均合格。珠海经济特区海泰生物制药有限公司的酶联免疫法试剂盒的有效性已经得到国内权威部门的认可，很多研究都使用该试剂盒做比对试验[16-17]，显示了其较好的性能，可信度高。在本次对比研究中，收集血清样本1050例，使用本公司研制的巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）与珠海经济特区海泰生物制药有限公司的巨细胞病毒IgG抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）分别测定样本中巨细胞病毒IgG抗体，χ2检验的P＞0.05，待考核试剂与对比试剂检测不一致的部分不存在统计学意义上的差异，一致性分析Kappa系数为0.9710，表明一致性优（κ＞0.75，表明一致性优；κ在0.40～0.75之间为一致性良好；κ＜0.4则表示一致性较差），即2种试剂盒有高度的一致性，有临床应用价值，对相关疾病可以提供有效的诊断和治疗依据。此外，可以依据中华人民共和国医药行业标准《干扰实验指南WS/T 416-2013》、《弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒抗体及G型免疫球蛋白抗体亲和力检测试剂技术审查指导原则》完成交叉、干扰实验，完善分析性能评估资料。

连续研制3批试剂盒，经以上性能评估，各批产品检测结果符合相关要求和规定，可为完善试剂盒的产品技术要求和产品说明书提供指引。