基于环介导等温扩增技术对人乳头瘤病毒的分型检测

孙萌，柴蕊，张亚兰

北京城市学院 生物医药学部，北京 100083

宫颈癌是威胁妇女健康的主要疾病之一，被认为是全球性公共卫生问题，是发展中国家最常见的癌症，世界上每2 min就会有1个妇女死于宫颈癌[1]。而人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染是宫颈癌和一些生殖器瘤样病变的主要原因。HPV有多种基因型，目前已知100多种，其中30余种可从受感染的生殖道组织中分离出来[2-4]。根据病毒致癌性的大小，可将HPV分为低危型（非癌相关型，包括HPV6、11、42、43和一些新型HPV）和高危型（癌相关型，包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）[5-6]。近10年来我国宫颈癌的发病率稳步上升且趋于年轻化，故对宫颈癌及癌前病变的早期发现、早期诊断、早期干预显得非常必要。

发达国家宫颈癌的筛查流程多为HPV检测和细胞学检查同时进行，异常者转阴道镜检查，可疑病变定点活检，随访以HPV检测和细胞学检查为主[7-12]。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP）是一种新型体外等温扩增特异性核酸片段的技术，该技术主要利用2对特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶在一定条件下进行反应，只需把基因模板、引物，链置换DNA合成酶等共同置于一定温度（60～65℃）下，可在15 min至1.5 h内出现109～1010倍的扩增。LAMP技术针对HPV的DNA检测，具有较高的特异性，操作简单、快速高效。通过LAMP完成HPV分型是一种快速检测HPV亚型的方法，对宫颈癌及癌前病变筛查具有重大意义，可为临床宫颈病变的诊治提供依据。HPV高危型有多种，除HPV59、HPV66、HPV68这3种亚型，其他高危型已经可以通过LAMP检测出来。因此，我们选取高危型HPV59、HPV66、HPV68作为实验样本开展研究。

1 材料和方法

1.1 材料

临床HPV样本购自浙江殷欣生物技术有限公司；微流控芯片、微流控芯片核酸分析仪由博奥生物集团有限公司提供；ABI7500实时荧光定量PCR仪购自上海智岩科学技术有限公司；LAMP DNA扩增试剂盒购自上海信裕生物技术有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 特异性靶序列筛选

登陆NCBI官网，检索HPV59、HPV66、HPV68亚型全基因组序列，并将其所对应的所有毒株序列分类下载。HPV亚型是根据其基因的L1和L2区的不同核酸序列进行命名。用核酸分析软件DNAMAN对HPV59序列进行多序列比对，选取变异少的L1、L2区序列并对该序列进行Blast比对，选定高特异性的HPV59靶序列片段。HPV66、HPV68片段选择同HPV59。如图1。

1.3 特异性引物设计

根据选定的特异性靶序列设计相应的引物组合（表1），并根据引物组合设计该组的颈环引物（LF、LB）。

1.4 引物溶解与混合

引物合成后按照说明书填写引物补水单，计算初次补水量。引物补水前12 000 r/min离心10 min，在超净工作台里按照补水单一一对应补加适量的灭菌水，充分振荡混匀，瞬时离心，于4℃放置2.5 h，使之完全溶解。用分光光度计测定每条引物的核酸浓度，清洁光纤表面，加2 μL灭菌水到光纤表面，放下检测壁，用滤纸将水吸干，如此可保证BLANK准确。吸取1.5 μL灭菌水加到下光纤表面，放下检测壁，点击BLANK做空白对照。加样测量，将1.5 μL核酸加到下光纤表面，放下检测壁，输入样本编号，点击Measure测量。将测量结果输入补水单，计算二次补水量。引物补二次水，在超净工作台里按照补水单一一对应补加适量的灭菌水，充分振荡混匀，瞬时离心，放置-20℃待用。引物溶解后，在EP管上标记好要配制的混合引物的名称，加入35 μL水，然后依次加入24 μL FIP、BIP，10 μL LB、LF，3 μL F3、B3，振荡混匀，瞬时离心，-20℃保存。

图1 选定的特异性靶序列

1.5 引物初筛

表1 引物组合及序列

将 HPV59、HPV66、HPV68质粒浓度由 1×109拷贝/μL梯度稀释到1×105拷贝/μL，吸取5.24 μL稀释后的质粒水溶液与3.67 μL LAMP扩增试剂混合，然后加入1.09 μL混合引物，振荡，瞬时离心。阴性对照只须将质粒换成灭菌水。将8联排管放入ABI7500实时荧光PCR仪，打开软件编辑程序，启动扩增程序。

1.6 环介导等温扩增技术引物灵敏度的检测

分析引物初步筛选结果，选择在1×105拷贝/μL条件下扩增出峰时间较早的引物进行灵敏度筛选。将HPV59、HPV66、HPV68质粒浓度由1×109拷贝/μL梯度稀释至1×103、1×102拷贝/μL。吸取5.24 μL稀释后的质粒水溶液与 3.67 μL LAMP扩增试剂混合，然后加入1.09 μL混合引物，振荡，瞬时离心。阴性对照只须将质粒换成灭菌水。将8联排管放入ABI7500实时荧光定量PCR仪，打开软件编辑程序，启动扩增程序。

2 结果

2.1 引物初筛

对HPV59、HPV66、HPV68通过选取对应核酸片段的LAMP结果见图2。使用设计的5组HPV59引物，在1×105拷贝/μL初筛质粒浓度下，扩增曲线出峰时间应在20 min，只有HPV59-2、HPV59-5较好，其他几条几乎没有扩增。HPV66引物设计了5组，初次筛选只有HPV66-2、HPV66-5扩增效果较好，其他出峰时间较晚，均不符合。HPV68引物设计了10组，其中HPV68-4、HPV68-10扩增结果较好。以上初筛选出的6组引物可作为下一步灵敏度检测的参考。

2.2 引物灵敏度检测

根据引物初筛结果，HPV59-5的出峰时间早于HPV59-2，所以选择HPV59-5进行灵敏度检测，结果见图 3。1×103拷贝/μL HPV59-5 扩增曲线出峰时间为37 min，1×102拷贝/μL HPV59-5扩增曲线出峰时间为33 min，且只有一条可出峰，阴性对照曲线没有扩增，由此可以得出HPV59-5的检测下限为1×102拷贝/μL。

根据引物初筛结果，HPV66-2、HPV66-5的灵敏度检测结果见图 4。1×103拷贝/μL HPV66-2扩增曲线出峰时间在30 min左右，1×103拷贝/μL HPV66-5扩增曲线出峰时间在40 min左右，且这2种引物在1×102拷贝/μL均没有扩增出，所以引物HPV66-2的灵敏度较好，HPV66-2的检测下限为1×103拷贝/μL。

图2 引物初筛结果

根据引物初筛结果，HPV68-4、HPV68-10的灵敏度检测结果见图 5。1×103和1×102拷贝/μL HPV68-4扩增曲线出峰时间都在46 min，1×103拷贝/μL HPV68-10扩增曲线出峰时间在25 min，1×102拷贝/μL HPV68-10扩增曲线出峰时间在40 min，早于引物HPV68-4，所以HPV68-10的灵敏度较好，检测下限为1×102拷贝/μL。

2.3 微流控芯片对HPV样本检测

将筛选好的HPV59、HPV66、HPV68亚型扩增引物加入微流控芯片，并在芯片中加入LAMP反应所需试剂，即制成可检测这3种亚型病毒的微流控芯片，配合微流控芯片核酸分析仪，即可实现对临床样本的快速分型检测。取3个已知感染类型的临床样本，分别标记为HPV59、HPV66、HPV68亚型，用微流控芯片进行测试，扩增曲线斜率超过30，则说明扩增反应已发生，软件自动判断结果为阳性；否则，为阴性。出峰时间和峰值与扩增反应效率呈正相关。结果如图6，A和B中橙色曲线代表实验的阳性对照，绿色曲线代表检测的目的指标HPV59和HPV66，蓝色曲线代表人基因；C中红色曲线代表实验的阳性对照，绿色曲线代表检测的目的指标HPV68，灰色曲线代表人基因（检测HPV59、HPV66、HPV68样本所使用的仪器不是同一台，因此曲线颜色代表的内容不同）。可以看出，扩增曲线有明显峰值出现，仪器显示为阳性，微流控芯片对这3份样本的检测结果与样本中HPV亚型的实际情况完全符合。

图3 HPV59-5引物灵敏度检测结果

图4 HPV66-2、HPV66-5引物灵敏度检测结果

3 讨论

针对 HPV59、HPV66、HPV68亚型的基因序列，分别设计筛选出一套适合反应的LAMP引物，将引物加入微流控芯片，对3份实际HPV样本进行检测，可以准确检测出样本的HPV亚型。研究表明，可利用LAMP技术对HPV的亚型进行准确分型，但需要解决一系列技术问题，才能确保结果的准确性。首先，要有良好的引物设计。在引物设计筛选过程中，HPV59引物共设计了3次，样本检测结果表明最后一次设计的引物较好，要使LAMP的反应效率提高，关键在于让4条引物在反应开始阶段与靶基因发生杂合反应，因此筛选引物时除了避免假阳性反应外，还要选择引物片段的大小，从而使Tm值处在一定范围内，引物的Tm 值应满足 F1c、B1c＞F2、B2＞F3、B3，且 F2和 B2的Tm值应该在BstDNA聚合酶的催化温度范围内，即60～65℃。F1c和B1c的Tm值要高于F2和B2的Tm值，这样从模板DNA上释放的DNA单链能够更快速地形成环状结构；而F2和B2的Tm值要高于F3和B3，从而保障内引物与靶基因的结合先于外引物。其次，在样本检测过程中要设法排除干扰因素，并控制好反应条件。例如，开始时是直接将HPV样本加入微流控芯片进行检测，但检出率很低，外对照出峰时间很晚，甚至扩增不出来。经分析认为可能是由于样本中干扰成分过多，对LAMP扩增的抑制作用过大。后将HPV样本进行适当的前处理，再加入浓缩全集成芯片进行检测，检出率明显提高。另外，考虑到温度会影响引物的反应，将微流控核酸分析仪的反应温度降低了2℃，将之前没有检出的样本在此条件下再次进行检测，有的样本可被检测为阳性。总之，在良好引物设计的基础上，通过优化检测条件，利用微流控芯片可以准确检测出临床样本中HPV的亚型。将LAMP技术与微流控芯片整合并用于HPV的分型检测，不仅可获得较高的灵敏度和特异性，还具备指标通量高、检测时间短等优势，预期在临床上有较好的应用前景。

图5 HPV68-4、HPV68-10引物灵敏度检测结果

图6 HPV样本检测结果