一测多评法同时测定穿心莲分散片中4种内酯类成分的含量

姜志远，刘世萍，马妍妍，李业雨

(1.黑龙江省农垦总局疾病预防控制中心，黑龙江 哈尔滨 150090；2.哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001)

穿心莲分散片是由穿心莲药材经提取物后，加入适当的辅料制备的速释片剂，具有清热解毒、凉血消肿的药理作用，在临床上广泛地应用于邪毒内盛，感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮。穿心莲分散片的药效成分有穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等二萜类内酯化合物。目前穿心莲分散片的质量标准只设定穿心莲内酯的含量限值，无法满足穿心莲分散片的质量控制要求。由于片剂的多指标成分质量评价及控制需要大量的化学对照品，同时二萜类内酯对照品的化学结构相似、不易制得、价格昂贵等原因，因此对穿心莲分散片的多指标成分质量评价，在实际生产中很难推广。本实验以含量较高、性质稳定的穿心莲内酯为参照物, 建立穿心莲分散片4种内酯类成分同步测定的一测多评法, 实现降低检测成本, 提高含量检测的质量和效率的目的,为穿心莲分散片的多指标质量评价及控制提供理论依据和参考方法。

1 仪器与试剂

1.1 药品试剂

穿心莲分散片(黑龙江乌苏里江制药有限公司哈尔滨分公司提供，规格:0.55 g/片，批号为20170301、20170302、20170303、20170304、20170401、20170402)。对照品穿心莲内酯(批号:110797-201609)、脱水穿心莲内酯(批号:110854-201710)购于中国食品药品检定研究院。新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯对照品购于上海中药标准化研究中心(经HPLC检测，面积归一化法计算,纯度>98%)。色谱纯乙腈(Merck公司生产),实验用水为自制的超纯水,其他的检测试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

Agilent 1100 型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；SHIMADZU LC-2010AHT型液相色谱仪(日本岛津制作所)；Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；BS210S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；KQ-600型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FiveEasy Plus型pH计(METTLER TOLEDO公司)；Milli-Q A10型超纯水系统(默克密理博公司)。

2 方法与结果

2.1 一测多评的实验方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：PhemomenexC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水,梯度洗脱:0～52 min,20%～40%乙腈；52～65 min,40%～80%乙腈；流速1.2 mL/min；柱温25℃；检测波长205 nm；进样量10 μL。内酯混合对照品和穿心莲分散片的HPLC图见图1。

图1 内酯混合对照品(A)和穿心莲分散片样品(B)HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取穿心莲的4种内酯对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL中含穿心莲内酯0.042 1 mg,新穿心莲内酯0.054 6 mg,去氧穿心莲内酯0.053 8 mg,脱水穿心莲内酯0.082 2 mg的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

取穿心莲分散片10片，除去包衣，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，振摇使其分散均匀，室温下浸泡1 h，置数控超声波清洗器内超声处理30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，振摇使其混合均匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液10 mL，置中性氧化铝柱(200～300目，5 g，柱内径为1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 内酯成分的线性关系考察

取2.1.2项下的穿心莲内酯混合对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别进样2、4、6、8、10、12、15、20 μL，测定内酯的峰面积。以内酯的峰面积(A)对进样量(μg)进行线性回归。结果见表1。

表1 穿心莲分散片中4种内酯成分的线性关系

2.1.5 精密度试验

取2.1.2项下的穿心莲内酯混合对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件连续进样10 μL，记录内酯成分的峰面积。结果穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等4种成分峰面积的RSD值分别为0.27%,0.34%,0.65%,0.41%,表明仪器精密度良好。

2.1.6 溶液稳定性试验

取穿心莲分散片(批号：20170301)，按2.1.3项下的制备方法制备供试品溶液，室温放置，在0、2、4、8、12、16、24 h分别进样10 μL，记录4种内酯类成分的峰面积，结果表明，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等4种成分峰面积的RSD值分别为0.37%, 0.52%,0.78%,0.42%, 说明穿心莲分散片的供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.1.7 重复性试验

取穿心莲分散片(批号：20170301)，按2.1.3项下的制备方法制备供试品溶液，平行配制6份，按2.1.1项下色谱条件进样，记录4种内酯类成分的峰面积。通过计算得到，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等4种内酯成分的含量分别为19.56,15.93, 22.27和21.42 mg/g,RSD值分别为0.35%,0.51%,0.86%和0.44%,说明设定的提取方法和检测方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的穿心莲分散片(批号：20170301)细粉0.2 g，精密加入等量的内酯混合对照品, 按2.1.3项下方法制备6份供试品溶液, 依法测定4种内酯成分的含量并计算平均加样回收率。结果表明，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等4种成分的平均加样回收率分别为99.07%,98.29%,96.73%,99.24%；RSD值分别为0.36%,0.42%,0.83%,0.75%,说明设定的提取方法和检测方法的准确度良好。

2.2 内酯成分的相对校正因子计算

取2.1.2项下的穿心莲内酯混合对照品溶液，按2.1.1项下的色谱条件精密进样2、5、10、15、20 μL，测定4种内酯类成分的峰面积。然后以穿心莲内酯为参照物, 根据公式Fr= (An×Ws) / (As×Wn)分别计算新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等3种待测成分的相对校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分别为相对校正因子、参照成分的峰面积及其质量浓度(mg/mL)、待测成分的峰面积及其质量浓度(mg/mL)。结果见表2。

表2 穿心莲分散片中3种待测皂苷类成分的相对校正因子

2.3 内酯成分的相对校正因子重复性考察

2.3.1 不同的检测仪器对相对校正因子的影响

考察不同品牌的2种色谱仪及3种色谱柱(规格均为:250 mm×4.6 mm,5 μm)对穿心莲分散片的4种内酯类成分相对校正因子的影响, 结果相对校正因子的RSD<2%, 表明使用不同品牌的检测仪器及色谱柱均具有良好的重现性。结果见表3。

2.3.2 待测成分色谱峰的定位

以穿心莲内酯的保留时间为定位标准, 计算新穿心莲内酯等3种待测成分在不同品牌色谱仪及色谱柱的相对保留时间。结果相对保留时间的RSD<2%, 说明在不同色谱仪和色谱柱下，相对保留时间的变化值较小, 重现性良好。结果见表4。

2.4 样品的含量测定

按设定的含量测定方法，用一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)同时测定6批穿心莲分散片样品中穿心莲内酯、新穿心莲内酯等4种成分的含量。结果表明，QAMS法测得的含量数据与ESM法测得的结果无显著差异(RSD<2%)。检测结果见表5。

表3 不同的液相色谱仪及色谱柱测得的相对校正因子

表4 不同的液相色谱仪及色谱柱测得的相对保留时间

表5 穿心莲分散片中4种内酯成分的含量测定比较结果表(mg/mL)

3 讨论

穿心莲分散片的化学成分比较单一,主要为二萜内酯类的4种成分。这些成分在同一色谱系统中的出峰时间及峰形等也会受到色谱柱、溶剂、柱温等诸多因素的影响，因此,待测成分色谱峰的定位非常重要，关系到实验结果的准确度。本实验采用穿心莲内酯的保留时间作为待测成分的定位标准，穿心莲内酯类成分的相对保留时间在不同的检测仪器及色谱柱条件下重现性较好(RSD值<2.0% )。

通过方法学研究，不同品牌的2种色谱仪及3种色谱柱对穿心莲分散片内酯类成分的相对校正因子和相对保留时间影响较小 (RSD<2%)。6批穿心莲分散片样品的含量测定结果表明: QAMS法测得的含量数据与ESM法测得的结果无显著差异,说明建立的QAMS法可对穿心莲分散片的4种内酯类成分的含量可以实现同步测定, 为穿心莲分散片的多指标质量控制提供了理论依据和参考方法。