桃红四物汤对浸润性乳腺癌Bcl-2、Bax及Ki-67蛋白表达的影响

傅思莹，何玉萍，王南卜，谢宇晖

(广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性癌症死亡的15%[1]，其发病是多因素、多基因、多阶段共同参与的结果。近年来乳腺癌的发病率逐年增高，且有年轻化趋势，严重威胁着女性的身心健康。桃红四物汤为中医传统活血化瘀经典方剂之一，近来被广泛用于脑缺血、心肌缺血、滑膜炎、椎间盘突出等等疾病的临床研究中，也有报道可通过降低肿瘤血管、淋巴管生成发挥抗肿瘤作用[2-3]。本研究采用免疫组化及流式细胞方法观察浸润性乳腺癌病例细胞增殖核抗原Ki-67、凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)的变化，旨在探讨桃红四物汤抗癌作用的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2010年1月1日—2011年12月31日收治的经病理确诊的浸润性乳腺癌患者60例，均为女性，平均年龄51.2岁，其中55例为浸润性导管癌，5例为浸润性小叶癌。20例行术前化疗(CAF/CEF或TAC/TEC方案) ，为化疗组；20例行术前化疗CAF/CEF或TAC/TEC方案) + 中药桃红四物汤，为复合药物组；20例未行术前化疗者，为对照组。

1.2 药物

桃红四物汤(药物组成:桃仁9 g，红花6 g，熟地黄12 g，当归9 g，白芍9 g，川芎6 g)加水500 mL，煎至200 mL，温服，每日1剂。复合药物组自化疗之日起连续服用桃红四物汤21 d为1疗程，所有药物由广州中医药大学第一附属医院药房提供。

1.3 主要试剂及仪器

鼠抗人Ki-67抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);Bcl-2-PE、IgG-PE(SantaCruz Biotechnology);Bax-PE、IgG-PE(武汉博世德生物有限公司);BECKMAN COULTER FC500流式细胞仪;BenchMark XT全自动免疫组化染色仪。

1.4 取材、实验方法及结果判定

各组病例均取手术后肿瘤标本常规取材脱水包埋制成石蜡块。

1.4.1 免疫组化

采用EnVison法，PBS代替一抗作为空白对照。每一例切片任意选取10个视野(×400)，每视野计数100个癌细胞中阳性细胞的个数，取其平均数，记为该例的阳性细胞数，以百分率表示。

1.4.2 流式细胞

采用何琳[4]等介绍的方法并稍作改良。取石蜡包埋组织在切片机上切取50 μm厚的组织片15～18片，置于试管内，加入二甲苯10 mL脱蜡48 h，每天更换1次，然后弃去二甲苯。依序加入100%、95%、70%、50%的梯度酒精5 mL水化,每次水化10 min,最后加入蒸馏水5 mL,5 min后倒出。将组织放入EP管内，加入1 mLPBS缓冲液，用眼科剪竖剪将组织剪碎，至颗粒直径在1～2 mm即可，然后将此混悬液移入流式管内，加入1 mL0.25%胰酶消化，37℃水浴20 min，期间每隔5 min震荡1次，然后加入生理盐水终止反应。用玻璃吸管轻轻吹打液体，将全部混悬液过100目钢丝网后得滤液，再经300目尼龙网过滤至流式管，PBS重悬洗3次，即得单细胞悬液。取单细胞悬液0.5 mL加入封闭液PAB2 mL，使用涡旋机摇匀后，室温放置15 min,离心1 200 r/min，5 min，去上清液，再加入1∶100稀释的一抗100 μL,摇匀后，室温避光，孵育30 min；加入PBS1mL，离心1 200 r/min，5 min，去上清液，加入PBS1 mL，流式细胞仪检测。每份样本均设阴性对照(加相应IgG抗体)，以消除本底荧光的影响。结果以阳性百分率表示。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 Ki-67蛋白的表达情况

Ki-67阳性部位为细胞核，对照组阳性细胞多，染色较深，化疗组及复合药物组阳性细胞较少，染色较弱，各组表达情况见图1。计数阳性细胞百分率，与对照组比较，化疗组及复合药物组Ki-67阳性百分率均明显下降，但组间差异无统计学意义。见表1。

图1 各组Ki-67表达情况(IHC,×100)

2.2 Bcl-2、Bax蛋白的变化情况

根据机测阳性百分率，从对照组、化疗组至复合药物组，Bcl-2蛋白数值逐渐下降，Bax蛋白逐渐升高，Bcl-2/Bax比值逐渐下降，且各组间差异均具有统计学意义。见表1。部分机测图形见图2。

图2 各组部分流式细胞图

组别例数 Ki-67(%)Bcl-2+(%)Bax+(%)Bcl-2/Bax比值对照组20 27.4±9.5 43.7±5.138.9±6.21.2±0.3化疗组20 20.6±6.8▲ 37.9±5.1▲ 44.9±7.3▲0.9±0.3▲联合用药组 20 20.1±7.3▲ 32.9±2.9▲◆ 56.2±9.6▲◆0.6±0.1▲◆

注：与对照组比较，▲P<0.05；与化疗组比较，◆P<0.05

3 讨论

乳腺癌因其发病率的增高及年轻化趋势受到临床及科研的广泛重视。而除了西医治疗手段，在我国传统医学宝库中寻找治疗方法也成为研究的热门。乳腺癌在中医学属于“乳岩”“乳石痈”“乳痞”“乳发”“乳核”“妒乳”等范畴，在千年以前即有对此病的描述。明代陈实功在《外科正宗》里写道“又忧郁伤肝，思虑伤脾，积想在心，所愿不得志者，致经络痞涩，聚结成核，初如豆大，渐若棋子；日后肿如堆栗，或如覆碗，紫色气秽，渐渐溃烂，深者如岩穴，凸者若泛莲，疼痛连心，出血则臭，其时五脏俱衰，四大不救，名曰乳岩。”形成原因包括七情所伤、饮食失节、体质因素等，朱丹溪认为：“乳癌是忧患郁闷，晰夕积累，脾气消阻，肝气横逆所致”。辨证论治是中医治疗的精髓所在，因此分析、研究、总结、判断乳腺癌的中医证型具有重要意义，是有效治疗的前提。实际临床工作中病情复杂多变，且存在巨大的个体差异性，不同医家提出了多种乳腺癌的辨证分型。吴继萍等提出中医证型分为正虚与表实两大类，其中表实分为血瘀、气滞、痰湿、热毒四种[5]。血瘀证是其常见症型之一，多位学者研究证实乳腺癌患者多合并有血瘀证，且血瘀程度与病程相关。富琦等发现与早期比较，晚期乳腺癌患者血瘀比例增高，并且血瘀证分级明显增高，有统计学差异[6]。李淑艳报道在0期、Ⅰ期、Ⅱ期乳腺癌患者中非血瘀证比例较高，分别占80.0%、68.3%和66.4%，而Ⅲ期患者中血瘀证比例较高，占58.7%，差异具有统计学意义，提示晚期乳腺癌患者血瘀证比例较高。另外，在肿瘤大于5cm，腋窝淋巴结转移数目≥4个的组别中，血瘀证患者比例较高，且具有统计学意义[7]。由于原位癌病例仅为0期，浸润癌病例为Ⅰ期或以上，故浸润性乳腺癌病例血瘀证比例明显高于非浸润性病例。李亚琼等发现新辅助化疗前后患者血瘀状态加重，差异有统计学意义[8]。

既然确实有“血瘀”存在，且病情越重，“血瘀”程度也越重，这就表明确实有应用活血化瘀药物的指征。古今对乳腺癌的治疗均重视补益气血药和理气解郁药的使用，重视清热解毒和活血化瘀。活血化瘀、攻补兼施的治法及中药复方治疗具有明确的疗效[9]。《医宗金鉴》中的桃红四物汤，是活血化瘀组方中的经典方剂。其6味组成中药分别为：桃仁、红花、白芍、当归、熟地黄、川芎。桃红四物汤具有养血活血、祛瘀生新的功效。在临床，桃红四物汤对于冠心病心绞痛、胃肠道疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、神经性疾病及各种妇科和皮肤科疾病均有较好的治疗效果[10]。在本研究中，加用桃红四物汤旨在以行气、活血药疏通气血，达到以通为补的目的，改善患者的气滞血瘀体质。而至于其作用机制，在抗肿瘤方面，已有研究报道桃红四物汤可减少肿瘤血管及淋巴管生成，降低微血管密度及淋巴管密度，从而起到一定的抗肿瘤疗效。另有学者报道在小鼠肺癌模型中桃红四物汤相似的抗肿瘤机制[11]。连红琴报道在实验性大肠癌中桃红四物汤可对凋亡相关蛋白产生影响[12]，但在乳腺癌病例中桃红四物汤对凋亡蛋白及凋亡基因的影响鲜见报道。

正常人体细胞的生长与死亡受到机体精准的调控，在生理情况下细胞的死亡称为凋亡，而细胞凋亡受到抑制，则本应被更新的细胞可能获得永生性，导致肿瘤的发生。而另一方面，如果促进恶性肿瘤细胞发生自发凋亡可能会发生导致肿瘤消退的治疗作用。因此，对凋亡基因的研究受到广泛的重视。Bcl-2基因家族是最早开展研究的凋亡相关基因，其中Bcl-2是t(14:18)染色体异位断点处发现的一种癌基因，是一种凋亡抑制基因，其作用机理包括抗氧化、抑制Bax的细胞毒、抑制促凋亡蛋白酶释放等。而Bax是促凋亡基因，自身可形成同源二聚体，破坏线粒体膜，从而形成凋亡启动复合体，激活半胱天冬酶的级联反应，导致细胞死亡；此外，它也可以与Bcl-2蛋白形成异源二聚体复合物，拮抗其自身的促凋亡作用。因此，Bcl-2/Bax比值是决定肿瘤细胞是增殖还是凋亡的重要环节[13-14]。由此可见，如果可以通过药物干预Bcl-2、Bax的任一项或者两项使得该比值下调，就可能使得肿瘤细胞凋亡相比肿瘤细胞增殖占有优势，发挥抗肿瘤作用。在本实验中，观察到使用化疗药物组及联合用药组均见Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达升高，Bcl-2/Bax比值降低，且联合用药组效果更为明显，说明桃红四物汤联合化疗药物更能促进肿瘤细胞凋亡，抗癌作用更为明显。

细胞增殖核抗原Ki-67是一种大分子的DNA结合蛋白，定位于细胞核，在有丝分裂中对维持DNA结构具有重要作用。处于静止期的细胞Ki-67染色为阴性，G1后期开始出现，S期和G2期逐渐升高，M期达到高峰。成熟组织细胞中不表达，由于其半衰期短，是一个比较肯定的核增殖标志物，目前Ki-67检测已经被广泛用于反映肿瘤细胞增殖速度和预测肿瘤预后[15-16]。其表达增多表明肿瘤增殖活性高，生长快，恶性程度强。有学者报道Ki-67在乳腺癌组织中表达量显著高于癌旁组织，且表达强度与不良预后相关[17]，阳性率达68.2%。本研究观察到，化疗药物组及联合用药组，Ki-67表达均明显减少，但联合用药组与化疗组间差异不具有统计学意义，提示Ki-67可能不是桃红四物汤的作用靶点。

我们认为，桃红四物汤对浸润性乳腺癌细胞凋亡有一定的抑制作用，但其影响凋亡信号通路的相关分子机制，以及可能的量效关系等等问题仍不明确，还有待进一步的研究工作。