黄芩药材商品规格与内在质量相关性研究

刘婷，孔铭，刘丽芳，李松林*

(1.中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009;2.江苏省中医药研究院和中国中医科学院江苏分院中药代谢组研究室，江苏 南京 210028;3.南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室，江苏 南京 210028)

黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根，气微，味苦，性寒；归肺、胆、脾、大肠、小肠经；具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效[1]，是临床常用药材。现代药理学研究表明，黄芩具有抗菌、抗炎、保护心脑血管等药理作用[2-3]。黄芩主要含有黄酮类化学成分[4-7]，其中黄芩苷为主要成分，具有抗病毒、抗氧化和神经保护的作用。《中国药典》(2015年版，一部)中以黄芩苷(≥9.0%)的质量分数作为评价黄芩药材质量优劣的标准，此外黄芩中还含有汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、夏佛塔苷和芹菜素等黄酮类化学成分，它们也都具有一定的抗菌、抗病毒及解热抗炎的功效。黄芩中还含有苯乙醇苷类化学成分，其中毛蕊花糖苷是黄芩中一种主要的苯乙醇苷类成分，具有抗炎、免疫调节的活性[8-9]。

黄芩主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河南、河北、山西、甘肃等地，其中河北、山西、内蒙古产量最大[10]。现行的黄芩等级规格的划分是依据1984年国家医药管理局和卫生部联合颁布的《76种药材商品规格标准》[11]，将黄芩分为条芩和枯芩两种规格，条芩系指内部充实的新根、幼根，枯芩系指枯老腐朽的老根。其中，又根据条芩的长度与直径将其细分为一等和二等两种等级，一等条长10 cm以上，中部直径1 cm以上；二等条长4 cm以上，中部直径1 cm以下，但不小于0.4 cm[12]。然而，目前的等级标准仅以外观性状为指标，缺乏对药材内在品质的描述，现有等级标准是否体现出黄芩药材内在质量尚缺乏深入研究。本研究采集了三个产地的不同商品规格的条芩，采用创建的HPLC法同时测定黄芩中9种主要活性成分的含量[13-17]，通过与外观性状比较及聚类分析，探讨黄芩中条芩商品规格与内在质量的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芩药材采集于河北、山东、山西，由江苏省中医药研究院李松林研究员鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根。药材信息见表1。

对照品黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A购自中国食品药品检定研究院(质量分数≥98%，批号分别为110715-200514、071114、051222、080325);对照品黄芩素、白杨素、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷购自四川省成都市维克奇生物科技有限公司(质量分数≥98%，批号分别为wkq16011504、wkq16032304、wkq16071404、wkq15122405、wkq16062004)；色谱级甲醇(江苏汉邦科技有限公司)；色谱级乙腈(美国天地有限公司)；超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

AT201十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)；Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);Waters 2996、2489紫外检测器(美国Waters公司)；KQ-500D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)；粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；DK-S28型恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)；Microfuge16台式微量离心机，美国贝尔曼库尔特有限公司。

2 结果与分析

2.1 药材外观性状的测定

对河北、山东、山西3个不同产地，条芩一等、条芩二等2种不同规格，共18批黄芩药材外观性状进行测定。每批随机抽取56根药材，分别用直尺测量其长度、直径，并用电子秤称取每根药材重量，记录药材长度、直径及重量的平均值。同时对药材外观进行拍照记录。测定及拍照结果见表2及图1。

图1 黄芩药材照片

产地等级编号河北一等JSPACM-65-1JSPACM-65-2JSPACM-65-3二等JSPACM-65-4JSPACM-65-5JSPACM-65-6山东一等JSPACM-65-7JSPACM-65-8JSPACM-65-9二等JSPACM-65-10JSPACM-65-11JSPACM-65-12山西一等JSPACM-65-13JSPACM-65-14JSPACM-65-15二等JSPACM-65-16JSPACM-65-17JSPACM-65-18

表2 黄芩药材外观性状测定

本研究对不同产地(河北、山东、山西)一等和二等条芩药材外观性状进行了测定，结果显示不同产地(河北、山东、山西)的一等条芩药材条长和中部直径均大于二等，且一等条芩药材重量显著大于二等，其中山东一等条芩条长15.50 cm、中部直径1.25 cm、根部重量为14.98 g，显示为各项外观指标最优的黄芩药材。但不同产地之间的外观比较有一定差异，如山东的二等条芩长度、直径均大于河北的一等条芩。条芩药材外观性状的测定结果与《76种中药材商品规格标准》中对黄芩药材商品规格的划分标准基本一致，表明目前市场黄芩规格的划分以外观为主。

2.2 黄芩中9个主要活性成分的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备

取黄芩药材粉末0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声提取30 min，放冷。用70%乙醇补足减失重量，摇匀，吸取1 mL上清液，于13 000 r/min 离心10 min。即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备

依次称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成混合对照品储备液，使得对照液中的含量分别为999.44 μg/mL、269.92 μg/mL、59.95 μg/mL、10.26 μg/mL、7.99 μg/mL、4.10 μg/mL、4.10 μg/mL、4.11 μg/mL、5.59 μg/mL。

2.2.3 色谱条件

色谱柱为AltimaTMC18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱：0～20 min，10%～25%乙腈；20～35 min，25%～30%乙腈；35～40 min，30%～40%乙腈；40～50 min，40%～50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；柱温35 ℃；进样体积10 μL；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm。

2.2.4 专属性考察

精密吸取对照品和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录60 min内的色谱图。结果显示，供试品液相色谱图中能指认黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素和千层纸素A共6种黄酮类成分，分离良好。另外3种成分夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷无法指认。混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图3。

图2 化合物结构图1.黄芩苷;2.汉黄芩苷;3.黄芩素;4.汉黄芩素;5.白杨素;6.千层纸素A;7.夏佛塔苷;8.芹菜素;9.毛蕊花糖苷

2.2.5 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液，加甲醇逐级稀释成5个不同浓度的混合对照品溶液。在“2.2.3”项色谱条件下进样分析，以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制峰面积与浓度之间的标准曲线，得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷的回归方程分别为Y=26 623X+165 348，R2=1.000 0、Y=28 027X+26 890，R2=0.999 9、Y=48 297X-96 525，R2=0.999 8、Y=36 185X+88 767，R2=0.995 6、Y=33 302X-1633，R2=0.998 7、Y=23 068X+6313，R2=0.984 1、Y=9977X-133，R2=0.999 9、Y=24 349X-3291，R2=0.998 2、Y=5231X-521，R2=1.000 0。结果表明，上述9种成分在62.47～994.44、16.87～269.92、3.75～59.95、0.64～10.26、0.50～7.99、0.26～4.10、0.26～4.10、0.26～4.11、0.35～5.59 μg/mL内线性关系良好。

图3 高效液相色谱图A-混合对照品;B-供试品(1-黄芩苷;2-汉黄芩苷;3-黄芩素;4-汉黄芩素;5-白杨素;6-千层纸素A;7-夏佛塔苷;8-毛蕊花糖苷;9-芹菜素)

2.2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，记录各组分色谱峰面积。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷峰面积的RSD值分别为0.38%、0.55%、1.93%、0.83%、1.15%、0.91%、0.91%、1.19%和1.07%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液(编号JSPACM-65-1)，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，记录各组分峰面积。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素和千层纸素A的RSD值分别为0.31%、0.29%、0.77%、0.48%、0.60%和1.99%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.8 重复性试验

取同一批黄芩药材粉末(编号JSPACM-65-1)，平行制备6份供试品溶液。在“2.2.3”项下进样分析，记录各组分峰面积。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素和千层纸素A质量分数的RSD值分别为0.87%、1.04%、1.54%、4.30%、1.28%和4.61%，表明该方法的重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验

取同一批已知含量的黄芩药材粉末(编号JSPACM-65-1)9份，每份0.05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分为3组，按样品中各指标成分量的50%、100%、150%分别加入一定量的对照品，用70%乙醇提取并稀释至50 mL。在“2.2”项下进样分析，计算各成分的加样回收率。结果见表3，6个主要成分的加样回收率结果均符合要求。

2.2.10 含量测定

取18批黄芩药材粉末，按“2.1.1”项下方法制备，每批药材平行实验3次。在“2.2.3”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，计算药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素和千层纸素A的含量，结果见图4。由图4可知，(1)不同产地条芩一等药材比较：山西产黄芩的黄芩苷、白杨素、千层纸素A含量均最高，分别为18.57%、0.14%、0.21%；山东产黄芩的黄芩素、汉黄芩素含量最低，分别为0.43%、0.09%；而总含量山西产的黄芩最高。其中同样一等的河北黄芩的黄芩苷含量比山西黄芩低14.11%，黄芩素含量低32.83%，白杨素和千层纸素A含量山西与山东存在明显差异，山西比山东分别高3.1倍、2.1倍。(2)不同产地条芩二等药材比较：河北产地的黄芩苷、汉黄芩苷含量最低，分别为16.73%、2.77%；山西产地的黄芩素、白杨素、千层纸素A含量最高，分别为1.08%、0.13%、0.18%；总含量山东产的黄芩最高。其中，河北和山东产黄芩的汉黄芩苷和汉黄芩素含量差异较大，汉黄芩苷含量河北是山东的1.2倍，汉黄芩素含量河北比山东高约1倍。(3)相同产地不同等级条芩药材比较：其中河北和山东的黄芩苷含量均是二等药材显著高于一等药材，其余各指标成分的含量一、二等之间未见明显差异。从含量测定结果来看不同产地之间黄芩有效成分含量有一定差异，但各不同等级之间未见明显差异，结果表明黄芩药材各主要成分含量与黄芩商品规格划分结果并不一致。

表3 加样回收率试验(n=3)

图4 黄芩含量测定结果(n=3)

2.3 聚类分析

为了更为直观的反映黄芩药材商品规格与内在成分含量的相关性，采用SPSS Statistics 19分析软件分别对不同产地(河北、山东、山西)一等和二等条芩药材含量测定结果进行聚类分析，结果见图5。聚类分析将不同产地(河北、山东、山西)一等和二等条芩药材分为两类，河北一等3批药材、河北二等2批药材、山东一等1批药材共6批药材被分为一类，其余12批药材被分为一类。聚类分析结果与黄芩等级划分结果并不一致，提示传统的黄芩药材商品规格划分与其内在成分含量没有相关性。

图5 黄芩含量测定结果聚类分析(n=3)

2.4 相关性分析

为了进一步探究黄芩药材商品规格与每个内在成分含量之间的关系，采用SPSS Statistics 19分析软件分别对不同等级的18批黄芩药材含量测定结果进行相关性分析。结果见表4。由相关性分析可知，黄芩药材等级与黄芩苷含量的相关系数为0.637(0

表4 黄芩等级与6个成分含量的相关性分析

注：P<0.05，相关性显著；P<0.01，相关性极显著。

3 讨论

黄芩药材规格划分的历史由来已久。梁代陶弘景在《本草经集注》[18]中提出：“圆者名子芩，破者名宿草(枯芩)，其腹中皆烂，故名腐肠。”这是首次将黄芩分为子芩和枯芩两种类型。明代李时珍[19]进一步对子芩和枯芩进行了区分，提出“宿芩乃旧根，多中心空，外黄内黑；子芩乃新根，多内实”的观点。其他中医药典籍中常记载有2种规格，即子芩(条芩)和宿芩(枯芩)，两者由于生长年限不同，也有认为两者是药性不同，功能主治有差异。近年来随着黄芩需求量的不断增加和野生植物资源的日益枯竭，黄芩栽培品受到有关部门的重视，目前黄芩以栽培为主，野生较少[10,20]。栽培年限1～3年不等，野生生长期在3年以上。野生黄芩采集以3～4月为佳，栽培黄芩11月采集为佳。一般认为条芩色黄坚实者质优[10,21]，颜色偏绿者质量为差，外观性状是评价其质量优劣的重要标准。本研究相关性分析结果显示，黄芩等级越高，黄芩苷和千层纸素A含量越低，与其他成分无相关。但整体的聚类分析结果显示，黄芩等级与其内在质量不一致。黄芩中的代表性活性成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和白杨素等的含量与传统等级标准均不相符，原有的等级标准仅能反映黄芩外观的优劣，尚不能体现黄芩内在质量的好坏，产生这种现象的原因可能与黄芩产地、种植、加工方式的变化有关。此外，随着黄芩在生产、流通的不断变化及药材实际规格的改变，原有的等级标准的合理性尚有待进一步验证。建议开展以内在质量和临床疗效为依据的黄芩药材分级研究，将药材外观性状、内部化学组分和疗效结合起来进行量化研究，完善黄芩药材商品等级规范。